Ученые впервые восстановили активность замороженного мозга мыши.
Исследователи из Университета Эрлангена-Нюрнберга совершили важный шаг в криобиологии, успешно восстановив функции мозга мыши после глубокой заморозки. Ученые применили метод витрификации, позволивший избежать повреждения тканей кристаллами льда и сохранить метаболическую активность нейронов.
Научный прорыв немецких биофизиков из Университета имени Фридриха-Александра в Эрлангене-Нюрнберге стирает границы между биологической смертью и временным анабиозом. Исследователям впервые удалось восстановить функциональную электрическую активность гиппокампа взрослого млекопитающего после глубокой заморозки до -196 °C. Это достижение доказывает: сознание и память, зашифрованные в структуре нейронных связей, способны пережить полную остановку молекулярного движения.
Криоконсервация сложных тканей мозга ранее считалась невозможной из-за разрушительного действия кристаллов льда, которые буквально разрывают клеточные мембраны. Однако применение метода витрификации позволило превратить биологическую жидкость в аморфное "стекло", сохранив архитектуру дендритов и синапсов. Успех эксперимента открывает новые горизонты в трансплантологии и изучении фундаментальных основ работы человеческого разума.
Криоконсервация тканей головного мозга взрослых особей сопряжена с трудностями из-за повреждения при образовании льда, а традиционные методы замораживания не позволяют сохранить структуру и функции нейронов. Витрификация — многообещающая альтернатива, но ее применение на тканях головного мозга ранее не изучалось.
Группа ученых из Германии продемонстрировала метод криоконсервации и размораживания мышиного мозга, который частично сохраняет его функциональность. В исследовании, опубликованном 3 марта в Proceedings of the National Academy of Sciences, подробно описывается использование авторами метода витрификации, при котором ткани сохраняются в стеклообразном состоянии, а также процесса размораживания, сохраняющего живые ткани.
«Если функция мозга является эмерджентным свойством его физической структуры, то как мы можем восстановить ее после полного отключения?» — задается вопросом Александр Герман (Alexander German), невролог из Университета Эрлангена — Нюрнберга в Германии и ведущий автор исследования. По его словам, полученные результаты указывают на возможность в будущем защитить мозг во время болезни или после тяжелой травмы, создать банки органов и даже добиться криоконсервации всего тела млекопитающих.
Основная причина, по которой мозг не может полностью восстановиться после заморозки, — повреждения, вызванные образованием кристаллов льда. Они смещают или повреждают хрупкую наноструктуру тканей, нарушая ключевые клеточные процессы. «Помимо льда, мы должны учитывать несколько факторов, в том числе осмотический стресс и токсичность криопротекторов», — говорит Герман.
Герман и его коллеги обратились к методу криоконсервации без использования льда — витрификации — в попытке сохранить функции мозга. Традиционная заморозка превращает воду внутри клеток в острые кристаллы, что фатально для нейронных сетей. Чтобы обойти этот физический барьер, ученые использовали витрификацию — процесс перехода жидкости в стеклообразное состояние без кристаллизации. Это достигается путем замещения части воды в тканях специализированными криопротекторами (раствор V3), действующими как биологический "антифриз". Подобно тому, как токсины искажают архитектуру мозга на этапе развития, ошибки в концентрации криозащиты могут разрушить клетку изнутри. При витрификации жидкость охлаждается достаточно быстро, чтобы молекулы перешли в дезорганизованное, стекловидное состояние до того, как они успеют образовать кристаллы льда. «Мы хотели проверить, можно ли восстановить функции после полного прекращения молекулярной подвижности в стекловидном состоянии», — говорит Герман.
Сначала они протестировали свой метод на срезах мышиного мозга толщиной 350 микрометров, включающих гиппокамп — ключевой отдел мозга, отвечающий за память и пространственную ориентацию. Срезы мозга предварительно обрабатывали в растворе, содержащем криопротекторные вещества, а затем быстро охлаждали с помощью жидкого азота до температуры −196 °C. После этого их хранили в морозильной камере при температуре −150 °C в стекловидном состоянии от десяти минут до семи дней.
После размораживания срезов мозга в теплых растворах ученые проанализировали ткани, чтобы выяснить, сохранилась ли в них какая-либо функциональная активность. Микроскопия показала, что нейронные и синаптические мембраны целы, а тесты на активность митохондрий не выявили метаболических нарушений. Электрические записи активности нейронов показали, что, несмотря на умеренные отклонения от показателей контрольных клеток, реакция нейронов на электрические стимулы была близка к нормальной.
В ходе эксперимента было доказано, что нейроны сохраняют не только свою форму, но и энергетический потенциал. Метаболическая активность митохондрий после размораживания осталась на жизнеспособном уровне. Хотя воздействие химических реагентов вызывает определенный стресс, он несопоставим с механическими повреждениями от игл льда. Исследование показало, что тонкая настройка биохимического состава среды позволяет защитить даже самые чувствительные структуры, такие как дендритные шипики.
Главным критерием успеха стала электрофизиологическая проверка. Ученые стимулировали синапсы — места соединений между клетками — и зафиксировали ответные электрические сигналы. Оказалось, что мозг сохранил способность к долговременной потенциации (ДВП). Это явление считается биологическим фундаментом памяти и обучения. Если проводить аналогию, то исследователи смогли "выключить и снова включить" жесткий диск, не потеряв записанные на нем данные.
Интересно, что разные типы клеток реагировали на экстремальный холод неодинаково. Пирамидальные клетки области CA1 требовали более мощной стимуляции для активации, в то время как гранулярные клетки сохраняли исходную возбудимость. Подобная избирательность тканей напоминает процессы, когда биохимический шторм при панике избирательно воздействует на вегетатику, оставляя другие системы нетронутыми. Поддержание баланса между возбуждением и торможением крайне важно для предотвращения патологических состояний после реанимации.
Переход от отдельных срезов к витрификации всего мозга внутри черепной коробки столкнулся с проблемой гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Клетки-астроциты, регулирующие обмен веществ, препятствовали проникновению криопротекторов, вызывая обезвоживание ткани. Ученые применили "перемежающееся уравновешивание" — цикличную смену растворов, что позволило сохранить объем органа. В этом контексте важно понимать, что микрофлора кишечника влияет на восстановление мозга, работая в синергии с внутренними системами защиты, которые здесь пришлось имитировать искусственно. Техническая сложность витрификации целого органа заключается в равномерности распределения веществ. Мы видим, что функциональная активность восстановилась лишь частично, что указывает на необходимость индивидуального подбора протоколов регидратации для разных отделов ЦНС. Несмотря на вариативность результатов (успех в 1 из 3 попыток на целом мозге), сам факт регистрации потенциалов действия в зубчатой извилине после размораживания является вехой. Подобно тому, как температура у ребенка запускает каскад иммунных реакций, криогенный стресс активирует скрытые механизмы выживания, которые ученым еще предстоит детально изучить методами молекулярной биологии.
Витрификация срезов головного мозга взрослой мыши.
(A) Временная шкала протокола витрификации с различной температурой (вверху) и концентрацией CPA (внизу). Стрелками указано, в какой момент происходит переход в свежий раствор для витрификации. Пунктирной линией обозначено добавление 300 мМ маннитола в раствор-носитель для разгрузки. (B) Срезы мозга (толщиной 350 мкм) внутри сетки при температуре жидкого азота (i; −196 °C) демонстрируют явные признаки витрификации (глянцевые и прозрачные) в отличие от кристаллизации (матовые и непрозрачные; звездочка). Эта разница во внешнем виде исчезла после процесса повторного нагревания (ii; 5 минут при комнатной температуре). (C) Зависимое от концентрации влияние загрузки CPA на скорость потребления кислорода (СПК) тканью гиппокампа мыши. 0–20 минут: базальное дыхание. 20–40 мин: подавление дыхания, связанного с синтезом АТФ, с помощью олигомицина. 40–60 мин: максимальная дыхательная способность, вызванная с помощью FCCP. 60–80 мин: немитохондриальное дыхание, вызванное с помощью ротенона и антимицина А. Обратите внимание, что витрификация с использованием 59 % V3 по массе не повлияла на метаболизм по сравнению с инкубацией с использованием только 59 % V3 по массе. Статистические сравнения проводились с помощью одностороннего ANOVA с последующим использованием теста Даннета, *<0,05 **p<0,005 ***p<0.0005 **** p<0,0001. (D) Окрашивание по Нисслю срезов гиппокампа (30 мкм) без обработки (контроль; вверху) и после витрификации (через 5 часов после повторного прогревания; внизу) указывало на целостность цитоархитектуры. (E) Электронная микроскопия выявила хорошо сохранившуюся ультраструктуру в области CA1 остекленевшего гиппокампа. Сразу после завершения протокола витрификации и разгрузки CPA время от времени наблюдался астроглиальный и митохондриальный отек (i). После 10 часов инкубации в аCSF при комнатной температуре ультраструктура, включая митохондрии и синапсы (ii), дендриты и нейроны (iii), синапсы и миелиновые оболочки (iv), не отличается от контрольных срезов. Масштабные линейки: 1 см (B); 100 мкм (D); 0,5 мкм (i, ii, iv; E), 1 мкм (iii; E).
Результаты исследования подтверждают гипотезу о том, что работа мозга — это эмергентное свойство его физической структуры. Если архитектура связей сохранена, сознание может быть "перезагружено" после любого периода неактивности. Это кардинально меняет наше отношение к процессам старения и смерти. Правильное питание и правильный завтрак для регенерации клеток — лишь первый шаг к долголетию, тогда как крионика может стать его логическим завершением.
