Влияние криопротекторов и ряда органических добавок на процесс рекристаллизации льда в модельных системах

Новиков А.Н., Пичугин Ю.И., Линник Т.П.

Проблемы криобиологии, 1992, №2

Исследованы криопротекторы: этиленгликоль, 1,2-пропандиол, глицерин, формамид, ацетамид, диметилсульфоксид, диэтилсульфоксид, полиэтиленоксиды с молекулярными массамы 100-1500 и поливинилпирролидон-12000. Показано, что все вещества пассивируют скорость рекристаллизационного укрупнения кристаллов льда, при этом высокомолекулярные – наиболее значительно. Получены уравнения зависимости скорости укрупнения кристаллов льда в присутствии криопротекторов от их физико-химических свойств, предложен механизм их влияния на этот процесс.

В практике криобиологии необходимость исследования процесса рекристаллизационного укрупнения кристаллов льда во внеклеточной среде обусловлена возможностью деформационного влияния структуры льда на замораживаемые клетки [2, 3]. Поэтому представляет интерес изучение влияния на этот процесс ряда криопротекторов и некоторых органических добавок, которые могут найти применение как перспективные компоненты криозащитных сред.

Исследованы криопротекторы: этиленгликоль, 1,2-пропандиол, глицерин, формамид, ацетамид, диметилсульфоксид (ДМСО), диэтилсульфоксид (ДЭСО), полиэтиленоксиды (ПЭО) молекулярной массы 100, 400, 1500 и поливинилпирролидон молекулярной массы 12000 (ПВП-1200). Концентрация криопротекторов в среде составляла 10%. 

Для изучения влияния криопротекторов и физико-химических свойств их водных растворов на рекристаллизационное укрупнение кристаллов льда были измерены температура плавления 10%-х водных растворов криопротекторов, вязкость этих растворов при 0°C и поверхностная активность 0,1%-х растворов криопротекторов при 25°C. Методы определения физико-химических показателей приведены в работе [4].

Процесс рекристаллизации кристаллов льда изучался методом криоскопии: плазма крови человека с добавками определенных компонентов охлаждалась в криоприставке микроскопа, начальный размер образующихся кристаллов льда регулировался скоростью охлаждения и инициированием начала кристаллизации. Дисперсность кристаллов льда оценивалась методом секущих по изображению препарата на телеэкране [5]. Характеристикой процесса являлась скорость увеличения кристаллов льда за 9 мин. при постоянной температуре экспозиции -6,8° C. Погрешность оценки характеристики процесса составляла ±6,3% при p = 0,95.

Результаты экспериментальных исследований приведены в табл. 1. Полученные данные свидетельствуют о существенном снижении (до 24 раз) скорости укрупнения кристаллов льда в присутствии криопротекторов, при этом высокомолекулярные ПЭО-400, ПЭО-1500, ПЭО-12000 обладают большим пассивирующим действием. Используя метод многофакторного регрессионного анализа [6], получили зависимость скорости укрупнения кристаллов льда от физико-химических свойств криопротекторов:

У = 5,34 – 0,07 Х1 – 6,10Х2 – 0,23Х3 (1),

где У – скорость укрупнения кристаллов льда; Х1 – температура плавления 10 %-го раствора криопротектора; Х2 – вязкость 10 %-го раствора криопротектора; Х3 – поверхностная активность криопротектора. Коэффициенты регрессии полученного уравнения значимы при p = 0,1, уравнение адекватно при p = 0,01, F = 0,21. Из уравнения видно, что все исследованные физико-химические свойства криопротекторов влияют одинаково – снижают скорость рекристаллизационного укрупнения кристаллов льда. При этом по степени влияния рассмотренные свойства располагаются в ряд: вязкость (-6,10) > поверхностная активность (-0,23) > температура плавления (-0,07). Полученные данные противоречат общепринятым представлениям о механизме этого процесса [1, 8]. Так, повышение вязкости системы и поверхностной активности вещества, находящегося в кристаллизуемом растворе, пассивирует как скорость растворения, так и, возможно, рост кристаллов. Причиной данного эффекта является снижение скорости массообмена в растворе и на грани растворяющегося или растущего кристалла. Пассивирующее влияние на изучаемый процесс температуры плавления водного раствора криопротектора можно попытаться объяснить повышением количества связанной воды в растворе. Последнее также отразится на скорости массообмена при росте кристаллов льда и, следовательно, на самой скорости рекристаллизационного укрупнения кристаллов. В общем, процесс рекристаллизации пассивируется тем больше, чем выше вязкость раствора криопротекора и его поверхностная активность. Влияние характера взаимодействия криопротектора с водой, описываемого температурой плавления раствора, на данный процесс проявляется незначительно.

Рис. 1. Зависимость скорости укрупнения кристаллов льда от концентрации этиленгликоля и ПЭО-1500: х – этиленгликоль, • - ПЭО-1500
Рис. 2. Зависимость вязкости водных растворов этиленгликоля и ПЭО-1500 от их концентрации: х – этиленгликоль, • - ПЭО-1500

Полученные на рис. 1 и 2 зависимости позволяют предположить, что скорость рекристаллизационного укрупнения кристаллов льда определяется прежде всего повышением вязкости системы. Методом регрессионного анализа получены адекватные уравнения зависимости скорости укрупнения кристаллов льда от вязкости водных растворов, содержащих разное количество этиленгликоля (2) и ПЭО-1500 (3):

Анализ полученных зависимостей показывает, что пассивация исследуемого процесса происходит только при повышении вязкости растворов  этиленгликоля и ПЭО-1500 до величин 1,58 и 2,53 спз соответственно. Видимо, определяющими в этих условиях становятся концентрированный слой раствора криопротектора и наличие в нем свободных молекул воды, диффузия которых зависит от характера связи вода-криопротектор (энергия гидратации, число гидратации).

Отдельно изучено влияние глюкозы и сахарозы на процесс рекристаллизационного роста кристаллов льда при концентрации их в плазме крови человека 5% мас. Оба вещества вызывали значительную пассивацию процесса (до 20 раз). Механизм действия этих веществ неясен, так как нельзя объяснить столь существенное замедление процесса вязкостью их растворов. Присутствие в среде желатина и агара (концентрация 2,0 и 0,025 % соответственно) на скорость рекристаллизационного процесса не влияло. 

В табл. 2 представлены результаты исследования влияния добавок некоторых органических веществ в плазму крови человека на скорость укрупнения кристаллов льда в присутствии 10 %-го этиленгликоля. Наблюдается незначительное увеличение скорости укрупнения кристаллов льда (в 1,2 раза) при добавке триамона, поливинилового спирта, октаглицеридов алкенилянтарных кислот (СВ-133) и снижение ее в присутствии гидролизованного полиакрилонитрила и карбоксиметилцеллюлозы. Механизм пассивирующего влияния указанных органических добавок, вероятно, обусловлен сорбцией их молекул на границе раздела кристалл-расплав [7], приводящей к замедлению скорости массообмена. Однако механизм повышения скорости исследуемого процесса под влиянием триамона, поливинилового спирта и СВ-133 остался неясным. Можно только предположить, что данные добавки частично связывают этиленгликоль, нейтрализуя пассивирующее действие последнего на рекристаллизационный процесс. 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вода и водные растворы при температурах ниже 0°С/ Под ред. Ф. Франкса. – Киев: Наук. Думка, 1985. – 388 с.
2. Кулешова Л. Г., Худяков Г. А. Повреждение клеток почек сирийского хомячка при замораживании // Криобиология и криомедицина. – 1983. – Вып. 12. – С. 24-28.
3. Лозина-Лозинский Л. К. Очерки по криобиологии. – Л.: Наука, 1972. – 288 с.
4. Пичугин Ю. И. Зависимость цитотоксичности и криопротекторной активности диолов от их структуры и физико-химических свойств: Автореф. Дис. … канд. Биол. Наук. – Харьков, 1988. – 18 с.
5. Приборы и методы физического металловедения / Под ред. Ф. Вейнберга. – М.: Мир, 1973. – Вып. 1. – С. 276-331.
6. Стьюпер Э., Брюгер У., Джурс П. Машинный анализ связи химической структуры и биологической активности. – М. : Мир, 1982. – 235 с.
7. Уманский Я. С., Скаков Ю. А. Физика металлов. – М. : Атомиздат, 1978. – 352 с.
8. Френкель Я. И. Кинетическая теория жидкостей. – Л. : Наука, 1975. – 592 с.

Ин-т проблем криобиологии и криомедицины АН УССР, г. Харьков