Получение клатратов ксенона в воде и исследование их свойств импульсным методом ЯМР

Архангельский А.И., Волков В.Я., Исангалин Ф.Ш., Родин В.В.

В настоящее время принято считать, что механизм защитного действия криопротекторов во многом обусловлен их влиянием на процессы кристаллизации воды, гидратации бномембран и макромолекул [5, 7]. Анализ литературных данных показывает, что, кроме традиционных криопротекторов (глицерин, ДМСО, ПВП, ПЭГ и других), имеется ряд соединений, способных влиять на указанные параметры. Установлено, что некоторые анестетики, в том числе инертные газы, изменяют структуру биологических соединений в водной среде (3), влияя на состояние и количество связанной с биополимерами воды. В частности, в литературе есть сведения, что присутствие инертного газа ксенона в водных растворах гемоглобина повышает количество связанной с белком воды.

Замораживание водных растворов в присутствии инертных газов приводит к образованию кристаллической решетки, отличной по свойствам от решетки обычного льда [1]. Более того, повышенное давление инертных газов при положительных температурах приводит к образованию в растворах клатратных соединений, представляющих собой кристаллические структуры из молекул газа и воды [1]. Например, клатраты ксенона стабильны при 275° К и давлении не менее 0,15 МПа [1]. При замораживании эти клатраты могут способствовать образованию мелкокристаллических структур, являясь зародышами льдообразования. Исследование влияния ксенона и его клатратов на состояние воды в растворах будет способствовать выбору условий для его возможного применения в криобиологических целях.

Для изучения подвижности молекул воды и «гостя» в клатратных структурах использовался метод ЯМР [4,], однако для определения количества образующихся клатратов он еще не применялся. В данной статье методом импульсного ЯМР исследованы образование в воде клатратов ксенона и их молекулярная динамика в присутствии жидкой фазы.

Методика исследования. В работе использовали ксенон высокой чистоты (ГОСТ 1029—77). Бидистиллированную воду перед использованием продували ксеноном. Для проведения ЯМР-исследованнй клатратов ксенона были разработаны специальные стеклянные ампулы из пирекса с толщиной стенки 1 — 1,5 мм (рис. 1).

Рис. 1. Ампула для получения клатратов инертных газов: 1 — армированный полипропиленовый шланг; 2 — бронзовая втулка; 3 — бронзовая накидная гайка; 4 — силиконовая прокладка; 5 — резиновая пробка; 6 — игла от шприца «Рекорд» (ГОСТ 64—1—102—73); 7 — пирексная ампула с внешним диаметром 9,5 мм, внутренним — 6,5 мм и длиной 80 мм; 8 — раствор образца с клатратами.

Ампулы закрывали зажимным устройством из латуни, с помощью которого к стеклянному фланцу прижимается толстая прокладка из мягкой резины. Газ из баллона через редуктор подавался в ампулу с помощью медицинской иглы путем прокола резиновой прокладки. Для более надежной герметизации прокладку смазывали с обеих сторон силиконовой вакуумной смазкой, в которой резина не набухает. При введении и выведении иглы последняя смазывает канал прокола, улучшая герметизацию. В качестве материала прокладки использовали мягкую листовую вакуумную резину или резиновые пробки от пенициллиновых флаконов. Величину безопасного рабочего давления для ампул из пирекса рассчитывали по формуле Рраб — 14,1 Т ⁄ Д (МПа), где Т — толщина стенки ампулы; Д — диаметр внешней части, даны в миллиметрах. При контрольных испытаниях ампулы разрушались при давлении 5—7 МПа. Клатраты ксенона получали статическим методом [1]. Для этого 0,1—0,2 мл воды в описанной ампуле помещали в термостат с температурой 274—278° К. Образцы выдерживали под давлением газа 0,2—1,2 МПа до образования однородной снегообразной массы. Для ускорения процесса клатратообразования в некоторых случаях проводили инициацию путем механического встряхивания или кратковременного охлаждения стенок ампулы сухим льдом. При этих условиях клатраты образовывались за время от 1—2 суток до 1 часа.

Время спин-решеточной релаксации Т1 измеряли с помощью последовательности импульсов 180° = τ = 90°, а спин-спиновой Т2 — с помощью серии Kappa—Парселла—Мейбума—Гилла [6]. Температура в датчике ЯМР-релаксометра поддерживалась с точностью 1 ° С. «Мертвое время» приемника релаксометра ≈15 мкс, рабочая частота для протонов — 20 МГц.

Результаты и их обсуждение. Определение количества клатратов в образцах проводили по уменьшению спада свободной индукции (ССИ) после 90°-ного импульса. В результате исследования релаксационных характеристик образцов с клатратами было показано, что ССИ имеет две компоненты, которые можно отнести к клатратам и жидкой воде. Время релаксации короткой компоненты менее 25 мкс. Это свидетельствует о том, что подвижность молекул воды в клатратных структурах примерно на пять порядков ниже чем в жидкой воде (Т2 ≅ 2,6 с). Поскольку короткая компонента ССИ, обусловленная наличием клатратов, не регистрируется через 25 мкс после 90°-ного импульса, фиксирование измерительной точки на расстоянии 30 мкс и более позволяло измерять только ССИ протонов молекул жидкой воды. Процент молекул воды К, образовавших клатраты рассчитывали по формуле:

,

где Ао и Ак — амплитуда ССИ собственно до и после образования клатратов в образце.

В то же время в работе по температурной зависимости ширины линии ЯМР в клатратах ксенона выше 277° К получили величину Еа — 24,7±3,3 кДж⁄моль. Авторы работы считают, что эта энергия активации характеризует подвижность молекул в ячейках клатратов, так как используемый метод получения клатратов основывается на длительном выдерживании сильно измельченных кусочков льда при отрицательных температурах под высоким давлением ксенона и якобы исключает наличие какого-либо количества жидкой воды. Однако узкая линия ЯМР-поглощения, наблюдаемая на фоне широкой линии от протонов твердой фазы клатратов, скорее всего обусловлена жидкой водой, присутствующей на поверхности крупинок льда и не связанной в клатраты. Поэтому величина энергии активации, близка к величине Еа для жидкости, полученной в настоящей работе, и не может отражать состояние молекул в жестких клатратных структурах. Заметим, что определение энергии активации по таким графикам, когда при изменении температуры меняются не только подвижность молекул воды, но и соотношение жидкой и твердой фаз, представляется недостаточно корректным.

Как отмечалось, исследуемые образцы представляли собой смесь клатратного льда и значительного количества жидкой воды (70—80 % молекул в образце). При этом жидкая вода при перевертывании ампул не выливалась, что указывает на ее распределение в капиллярах между жесткими клатратнымн структурами. На существование микрогетерогенности указывает и снижение измеряемой величины Т2 протонов воды при образовании клатратов ксенона (см. рис. 2). В работе [2] отмечалось, что в гетерогенных системах из-за разницы в магнитных восприимчивостях жидкости и твердого тела на границе раздела фаз в магнитном поле возникает градиент намагниченности. В результате движение протонов молекул жидкой фазы в пограничном слое приводит к быстрому распаду ядерной намагниченности и снижению измеряемой величины Т2. Авторы работы [2] считают, что применение последовательности Карра—Парселла—Мейбума—Гилла при измерении Т2позволяет однозначно выделить вклад в релаксационный распад ядерной намагниченности, обусловленный диффузией частиц в неоднородном магнитном поле, и оценить величину неоднородности поля в объеме образца. Поэтому для оценки степени неоднородности раствора в настоящей работе было проведено исследование зависимости скорости поперечной релаксации 1/Т2 от интервала τ между импульсами в серии Карра—Парселла для воды с клатратами и без них (рис. 3). Скорость поперечной релаксации протонов молекул жидкой воды при изменении τ в диапазоне от 0,01 до 10 мс изменяется слабо, тогда как в присутствии клатратов 1/Т2 заметно увеличивается с возрастанием τ, когда величина τ превышает 1 мс. Используя известное соотношение для зависимости длины свободного пробега молекул от коэффициента самодиффузии х2 = 2Дτ, можно оценить характерный размер неоднородной области, в которой диффузионное движение молекул влияет на спад сигнала спинового эха. Эта оценка дает величину неоднородностей х ≥ мкм, что свидетельствует о том, что характерные размеры кристаллов клатратов ксенона, образующихся в чистой воде, — порядка 1 мкм. На основании изложенных результатов можно сделать такие выводы. Разработана методика получения клатратов газов в ампулах для ЯМР-исследований под давлением.

При описанных выше условиях эксперимента типичная доля воды, идущей на образование клатратов, составляла 15—30 % общего количества воды в исходном образце.

На рис. 2 в полулогарифмическом масштабе приведены зависимости времен продольной и поперечной релаксации протонов воды. В одном образце (рис. 2, кривые 2, 3) после образования клатратов при 275° К температуру понижали до 269° К (при этой температуре оставалось 10 % молекул жидкой воды общего количества воды в образце), а затем постепенно нагревали до 290° К, измеряя его релаксационные характеристики по мере нагрева. Другие образцы (рис. 2, кривые 1 4) после образования клатратов не замораживали, а нагревали от 274° до 288° К. Для предварительно замороженного образца величины времен релаксации Т1 и Т2 в области температур 274—281° К оказываются несколько ниже по сравнению с величинами Т1 и Т2 для незамороженного образца. Повидимому, это различие обусловлено дополнительным образованием клатратов ксенона при охлаждении, которые в отличие от обычного льда при отогреве плавятся в более широком интервале температур. Когда температура образцов с клатратами ксенона превышает 283° К. измеряемые величины Т1 становятся близкими к значениям T1 для чистой воды, но все же остаются меньше их на 8—10 %. Если по линейным участкам температурных зависимостей ln T1 на рис. 2 в области 280—290° К определить энергии активации Еа — движения молекул жидкой воды, то для предварительно замороженного образца величина Ea = 26,4±3,3 кДж ⁄ моль, а для незамороженного образца величина Eа = 20,9±2,5 кДж ⁄ моль близка к значению энергии активации для чистой воды.

Рис. 2. Температурная зависимость логарифма времени продольной Т1 (1, 2) и поперечной Т2 (3, 4) релаксации протонов волы в образцах с содержанием клатратов 25% (2, 3) и 16 % (1, 4).
Рис. 3. Зависимости скорости поперечной релаксации протонов l/T2 для чистой воды (1) и воды в присутствии клатратов ксенона (2) от времени разделения импульсов в серии Карра — Парселла — Мейбума — Гилла при температуре 280° К.

По данным ЯМР-релаксации подвижность молекул воды в клатратных структурах, стабилизированных ксеноном, примерно на пять порядков ниже по сравнению с подвижностью молекул жидкой воды.

Предложен способ определения количества клатратов газа по амплитуде медленной компоненты спада свободной индукции сигнала протонов методом ЯМР.

Установлено, что при образовании клатратов ксенона в растворах возникает жесткая разветвленная решетка из взаимосвязанных клатратных структур с характерным размером ячеек ∼ 1 мкм. В ячейках между кристаллами клатратов находится жидкая вода. Снижение подвижности молекул воды в ячейках, по-видимому, обусловлено влиянием растворенного газа и кристаллов клатратов.

Список литературы:

1. Бык С. Ш., .Макогон Ю. Ф.. Фомина В. И. Газовые гидраты. — М,: Химия, 1980.— 296 с.
2. Волков В. Я., Даутов Р. А., Непримеров Н. И. Стимулированное эхо и трансляционное движение ядер в гетерогенных системах. — В кн.: Радиоспектроскопия. Пермь. 1980. с. 189—193.
3. Родин В. В.. Архангельский А. И., Исангалин Ф. Ш., Волков В. Я. Исследование гидратов ксенона в водных растворах белков методом ЯМР-релаксацнн. — В кн.: Тез. докл. Всесоюз. снмпоз, «Магнит, резонанс в биологии и медицине". М.: Черноголовка, 1981. с. 115—116.
4. Робин В. В., Исангалин Ф. Ш., Волков В. Я. ЯМР-релаксацня в смеси вода-третичный бутиловый спирт. — Химия и технология воды, 1980. 2. № 6, с. 505— 508.
5. Скорняков Б. А., Вишневский В. И. Особенности механизма крконротекции глицерином. — Криобиология и криомедицина. 1980. вып. 6. с. 59—62.
6. Фаррар Т., Беккер Э. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР. — М.: Мир, 1973.— 164 с.
7. Шраго М. И. Биологические антифризы и криопротекторы. — Криобиология и криомедицина, 1977, вып. 3, с. 81—83.

Источник