Вы здесь

Опыт работы и перспективы в области глубокой гипотермии и использовании газовых криопротекторов

Тезисы к семинару Фонда перспективных исследований “Криоконсервация органов и тканей”

Научно-технический центр криобиологии и анабиоза, февраль 2014 г., Москва, scidep@ntckba.ru 

 

В период 2009-2013 гг. в НТЦ КБА проводились многочисленные опыты по трем направлениям: 

  1. Обратимая гипотермия крыс
  2. Витрификация различных органов животных
  3. Эксперименты с использование клатратообразующих веществ в качестве криопротекторов при криоконсервации .

Также мы изучали опыт известных иностранных исследовательских групп по данным направлениям,  а также по темам: медленная заморозка, градиентная заморозка, газовое охлаждение для витрификации, комбинированные методы криоконсервации.

Для осуществления нашей деятельности мы создали большое количество уникального оборудования и освоили необходимые методики. В данный момент мы готовим к публикации статьи о результатах нашей работы. Хотелось бы поделиться результатами нашей деятельности по пп. 1 и 3.

Гипотермия крыс

Многие исследователи криоконсервации органов и тканей недооценивают важность для состояния донорских органов первичного этапа охлаждения до температуры льдообразования, также, как и его согревания от этой температуры до нормальной температуры функционирования. Но только при получении хорошего результата на этом этапе возможно изучать влияние криопротекторов и методов криоконсервирования на органы при более низких температурах.

Этап глубокой гипотермии уже возможно осуществить для животных с полным восстановлением всех функций.

Мы разработали технологию обратимой гипотермии для крыс, применение которой позволяет нам обеспечить выживание молодых и здоровых крыс весом 180-300 г. после охлаждения до температуры +2-3°С, сохраняемой в течение 25-60 минут с общим временем клинической смерти до 2-2,5 ч.

Подобная технология глубокой обратимой гипотермии (asanguineous ultraprofound hypothermia) уже существует и для собак. В феврале 2008 года об этом заявила группа ученых из Института Сафара (Питтсбург, США) (Wu et al. 2007). Наши же партнеры осуществляли подобные эксперименты с 1984 года, обеспечивая успешное оживление после вдвое большего времени клинической смерти.

Опыты с клатратообразующими веществами

При контакте с водой ксенон при температуре ниже –1.6°C при атмосферном давлении образует клатрат – вещество, в котором молекулы воды образуют пространственный каркас, а атомы ксенона располагаются в полостях этого каркаса (Claussen 1951; Stackelberg and Müller 1951). Благодаря такому свойству, ряд авторов предложили использовать ксенон как криопротектор, связывающий воду в клатратах и предотвращающий, тем самым, образование льда (Prehoda 1969; Rodin, Isangalin et al. 1984; (Shcherbakov, Tel’pukhov et al. 2004; Sheleg, Hixon et al. 2008). Мы проводили опыты по криопротекции ксеноном и другими газами (далее газовая смесь № 1 и газовая смесь № 2)  на культурах пекарских дрожжей (S. cerevisidae)  и клеток млекопитающих, на мотыле и дафниях.

Также мы провели компьютерное моделирование взаимодействие ксенона с водой при разных температурах.  

Результаты экспериментов с S. cerevisidae

Дрожжи являются удобным объектом для изучения криоконсервации, поскольку криопроекторными эффектами для них обладает множество веществ (Breierova and Kockova-Kratochvilova 1992), вплоть до этанола с метанолом (Lewis, Learmonth, et al. 1994). Криоконсервация дрожжей проводилась по стандартным протоколам (Kruuv, Lepock, et al. 1978; Rowe and Lenny 1980; Wellman and Stewart 1973) с  ксеноном или газовой смесью № 1 вместо общепринятых криопроекторов.

Мы установили, что для дрожжей ксенон обладает криопротекторным эффектом при всех опробованных давлениях от 3 до 7 ат. При 6 ат ксенона выживаемость клеток составила 68.5±6%, что сравнимо с эффектом глицерина или ДМСО (50±25%). Без криопротекторов выживаемость дрожжей (определяемая методом дифференциальной окраски трипановым синим) была порядка 20-40%. Совместное применение глицерина или диметилсульфоксида с ксеноном синергетического эффекта не дало – выживаемость оказалась в среднем 71±15%.

Результаты по клеточным культурам (размораживание без декомпрессии)

В отличие от дрожжей, которые замораживались по простому протоколу, для культур клеток млекопитающих мы использовали градиентную заморозку (охлаждение на 1°С/ мин до -80°С ), которая ранее хорошо показала себя в нашей лаборатории, давая клеточную выживаемость не менее 85%, а чаще даже более 90% клеток.

Как оказалось, в экспериментальной группе в препаратах, замороженных с ксеноном при давлении более 3 ат любого протокола градиентной заморозки, во время разморозки имело место сильное пенообразование, а при микроскопии целые клетки не находились, а тем более – жизнеспособные. Вне зависимости от состава среды, наличия/отсутствия ДМСО и эмбриональной телячьей сыворотки и т. д.

В препаратах, замороженных с ксеноном при 2,5-3 ат, после размораживания микроскопически определялись части клеток, но, вне зависимости от наличия криопротекторов, все они были мертвы, на вид в лучшем случае полуразрушенные, напоминающие "тени эритроцитов" при лизисе.

Эти результаты заставили нас провести дополнительные исследования по определению поведения клатратов (см. раздел «Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой»).

Результаты экспериментов с дафниями

В данной серии опытов мы использовали вместо ксенона газовую смесь № 2, которая способна образовывать гидраты при тех же условия, что и ксенон. Согласно гипотезе клатратного анабиоза, можно использовать любые клатратообразующие инертные газы для получения клатратного анабиоза.

В отдельных опытах мы убедились, что газовая смесь № 2 не токсична для дафний. После серии предварительных опытов мы нашли оптимальные условия образования гидратов газовой смеси № 2 как в воде, так и в самих дафниях, а затем научились удалять газ без образования пузырьков в телах дафний.

Однако, нам не удалось наблюдать живых дафний при самых оптимальных процедурах образования и разрушения газовых гидратов смеси № 2. Мы планируем повторить эти опыты с применением ксенона.

Результаты компьютерного моделирования взаимодействия ксенона с водой

Нами проведён большой объём молекулярно-динамических расчётов поведения растворённого в воде ксенона при температурах около 0°С и ниже. Получены значения температур и концентраций, при которых происходит выпадение из раствора кристаллогидратов ксенона или, наоборот, его разложение. Полученные результаты позволили найти режим согревания, при котором гидраты ксенона разлагаются без образования газовой фазы – пузырьков, разрушающих клетки.

Было также проведено моделирование роста кристаллов льда в водном растворе ксенона. Выяснилось, что рост кристалла (и возрастание концентрации ксенона в окружающей воде) происходит до тех пор, пока концентрация не достигнет достаточно высоких значений; после этого рост кристалла прекращается, а остающийся раствор представляет собой аморфный гидрат ксенона.

На основании вышеописанного мы сделали следующие выводы: чтобы клетки остались целыми и жизнеспособными, необходимо, во-первых, разрушать клатрат при таком давлении, когда выделяющийся газ может целиком раствориться в окружающей жидкости. Во-вторых, после размораживания проводить постепенную декомпрессию, причем во время нее обеспечить как можно меньшую концентрацию ксенона во внеклеточном пространстве для большего облегчения выхода ксенона из клеток без перехода в газовую фазу.

В развитие данного исследования представляется важным смоделировать поведение ксенона и других инертных газов:

  • при более низких температурах (потребуется ещё бóльший объём вычислений);
  • в присутствии NaCl и других веществ, характерных для живой материи;
  • в присутствии стандартных криопротекторов;
  • в клеточных мембранах (есть основания считать, что инертные газы могут являться эффективными мембранопротекторами).

Результаты по клеточным культурам (декомпрессия после размораживания)

На основании сделанных компьютерного моделирования и опытов с мотылем был создан дополнительный балластный объем (примерно 150 мл), монтируемый на криобарокамеру, а перед согреванием в охлажденную барокамеру добавлялся гелий при давлении 8-10 ат. После чего криобарокамера в течение 2-3 мин. согревалась на водяной бане при 37°С, затем переносилась в емкость с водою комнатной температуры, в которой и проводилась декомпрессия длительностью 30-50 мин.

В результате, после такой декомпрессии у клеток, замороженных с ксеноном с добавлением традиционных криопротекторов (ДМСО, глицерин) появилась сравнимая с безксеноновым (азот при тех же давлениях) контролем выживаемость клеток при всех опробованных давлениях, в среднем  60±25%. Примечателен тот факт, что, как и в случае дрожжей, само по себе повышенное давление на выживаемость культур клеток млекопитающих не влияет.

К сожалению, у клеток, замороженных по градиентным протоколам только с ксеноном, выживаемость была нулевая. Хотя сами клетки были целыми, оформленными, но – мертвыми.

К нашему удивлению, контрольные эксперименты дали совершенно другие результаты. Препараты, замороженные по “дрожжевому протоколу” (2 ч. при -20°С, погружение барокамеры в жидкий азот) с 7 ат ксенона, показали клеточную выживаемость в 2,8±2,3% (от 0,5% до 8,1%). Препараты, замороженные по тому же протоколу с 6 ат газовой смеси №1 – 2,4±0,9% (от 1,6% до 4,4%). А препараты с разными вариантами ”шоковой заморозки” (максимально быстрое охлаждение от  0°С до -196°С путем погружения барокамеры в  жидкий азот) с 7 ат ксенона дали выживаемость соответственно в 10,5±4,4% и 22,5±13,4%

Все вышеперечисленное говорит о том, что применение газовых криопротекторов оказалось потенциально весьма перспективным, но требует разработки новых протоколов заморозки и программной декомпрессии.

Наши планы

Мы готовы продолжать исследования в данном направлении и надеемся получить при надлежащей поддержке и развитии дополнительных, связанных  технологий, работающую технологию обратимой криоконсервации сначала мелких объектов, а потом и целых органов животных, в том числе, человека.

Литература

1. Claussen, W. F. (1951). "Suggested Structures of Water in Inert Gas Hydrates." The Journal of Chemical Physics 19(2): 259-260.
2. Kruuv, J., J. R. Lepock, et al. (1978). "The effect of fluidity of membrane lipids on freeze-thaw survival of yeast." Cryobiology 15(1): 73-79.
3. Prehoda, R. W. (1969). Suspended Animation: The Research Possibility that May Allow Man to Conquer the Limiting Chains of Time, Chilton Book Company.
4. Rodin, V. V., F. S. Isangalin, et al. (1984). "Structure of protein solutions in a presence of xenon clathrate." Cryobiology & Cryo-Medicine 14: 3-7.
5. Rowe, A. W. and L. L. Lenny (1980). "Cryopreservation of granulocytes for transfusion: studies on human granulocyte isolation, the effect of glycerol on lysosomes, kinetics of glycerol uptake and cryopreservation with dimethyl sulfoxide and glycerol." Cryobiology 17(3): 198-212.
6. Shcherbakov, P. V., V. I. Tel’pukhov, et al. (2004). Method for Organs and Tissues Cryoconservation In Situ.
7. Sheleg, S., H. Hixon, et al. (2008). "Cardiac Mitochondria l Membrane Stability after Deep Hypothermia using a Xenon Clathrate Cryostasis Protocol - an Electron Microscopy Study." International Journal of Clinical and Experimental Pathology 1(5): 440-447.
8. Stackelberg, M. v. and H. R. Müller (1951). "On the Structure of Gas Hydrates." The Journal of Chemical Physics 19(10): 1319-1320.
9. Wellman, A. M. and G. G. Stewart (1973). "Storage of Brewing Yeasts by Liquid Nitrogen Refrigeration." Appl Microbiol 26(4): 577-583.
10. Wu X, T. Drabek, et al. (2007). "Emergency preservation and resuscitation with profound hypothermia, oxygen, and glucose allows reliable neurological recovery after 3 h of cardiac arrest from rapid exsanguination in dogs." Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 28: 302–311.

Презентация к докладу. Презентация готовилась несколько позже тезисов и содержит более точные данные. 

 

 

 

Поделиться