Криоконсервация SACCHAROMYCES CEREVISIDAE с использованием ксенона
Пульвер А. Ю., Целиковский А. В., Пульвер Н. А., Артюхов И. В., Перегудов А. Г.
Материалы Международной заочной научно-практической конференции "Теоретические и практические аспекты современной криобиологии"
Введение. Внимание к газовым кристаллогидратам (клатратам) не ослабевает со времен первоначального определения их структуры (Claussen 1951; Stackelberg and Mьller 1951). Клатраты природного газа – главный источник проблем в газовых трубопроводах (Sloan 2003) и в то же время - самый богатый на Земле источник ископаемого углеводородного топлива (Boswell 2009), играющий значительную роль в глобальных климатических изменениях (Kaiho, Arinobu et al. 1996; Sloan 2003).
До сих пор не опровергнута молекулярная теория общего наркоза (Pauling 1961), постулирующая, что газовые анестетики в силу липофильности концентрируются в клеточных мембранах нейронов, разобщая их взаимодействие за счет образования там кристаллогидратов, меняющих свойства синаптических мембран. Являясь сильнейшим и практически соответствующим представлениям анестезиологов об «идеальном газовом анестетике» ингаляционным наркозным средством (Hecker, Baumert et al. 2004), ксенон разрешен к применению в качестве такового на территории России и Германии. Помимо этого он используется в лечении наркомании и алкоголизма, так как является антагонистом NMDA- рецепторов (Kornetov, Shpisman et al. 2002), а самое главное – в качестве нейропротектора при реперфузионно-ишемическом синдроме различной локализации (особенно при инсультах) (Abraini, David et al. 2005; Weber, Toma et al. 2005; Derwall, Coburn et al. 2009), поскольку одновремено является еще и антагонистом кальция (Petzelt, Blom et al. 2003).
В криобиологии перспективы использования инертных газов для криоконсервации органов и тканей под повышенным давлением являются весьма заманчивыми, но до сих пор не реализованными. (Prehoda 1969; Rodin, Isangalin et al. 1984; Shcherbakov, Tel’pukhov et al. 2004; Sheleg, Hixon et al. 2008). На этом фоне, нужно учесть, что кристаллогидраты ксенона отличаются от клатратов прочих инертных газов тем, что имеют самую высокую (не считая радона – но тот еще более редок, а вдобавок и радиоактивен) температуру образования и сохранения стабильности – приблизительно -1,6°С при атмосферном давлении.
Главными потенциальными преимуществами использования ксенона в качестве газового криопротектора является его абсолютная нетоксичность. Более того, мы предполагаем, что ксенон обладает способностью ослаблять негативные воздействия низких температур на биологические образцы. Для его применения нет нужды менять состав криоконсервационной среды. В то время как даже самый малотоксичный криопротектор, глицерин, потенциально опасен своими гиперосмотическими эффектами (Greene, Athreya et al. 1970; Rowe and Lenny 1980; Kopeika, Kopeika et al. 2003).
Рис. 1. Чертеж криобарокамеры.
Материалы и методы. Для использования газовых криопротекторов под повышенным давлением из специальной бронзы, использующейся для изготовления криогенного оборудования, были изготовлены миниатюрные барокамеры под 2 мл криопробирки (рис. 1, 2). В одном из слотов криопробирок предусмотрена возможность установки температурного датчика, с тем, чтобы получилось 10 рабочих криопробирок и 1 температурный контроль. Барокамеры без вреда выдерживают охлаждение до температуры жидкого азота, снабжены сальниками из хладостойкой резины и силикона, термоизоляционными контейнерами-”чехлами” из пенопласта.
Рис. 2. Криобарокамеры с чехлами.
Рис. 3. Размещение криопробирок в барокамеры.
Из обыкновенных пекарских дрожжей (Saccharomyces Cerevisidae) была выделена стерильная культура, на которой и проводились все последующие эксперименты. Дрожжи сами по себе относительно неплохо переносят криогенные температуры, а в качестве криопротекторов для них могут быть использованы самые различные вещества (Breierova and Kockova-Kratochvilova 1992; Lewis, Learmonth et al. 1994), вплоть до этанола и метанола. Поэтому была выбрана максимально простая схема охлаждения/ согревания, позволяющая максимально отчетливо проявиться потенциальному эффекту криопротектора. Таким образом, разработанный нами протокол криоконсервации S. Cerevisidae учитывал большую теплоемкость криобарокамер и нестандартность криопротектора.
Рис. 4. Продувка и компрессия барокамеры ксеноном.
Рис. 5. Барокамеры в криотермостате при - 20°С.
Рис. 6. Помещение криопробирок в криохранилище.
Двухмиллилитровые криопробирки с суспензией культуры дрожжей (5-7х106 кл/мл) либо в чистом солодово-пептонном бульоне, либо в бульоне с добавлением 5% глицерина или диметилсульфоксида (ДМСО), при комнатной температуре в асептических условиях помещались в криобарокамеры (рис. 3). Те герметизировались, часть из них продувалась чистым ксеноном, после чего им же давление доводилось в них до запланированного (рис. 4). Остальные, в качестве контроля, оставались с обычным воздухом или чистым азотом либо при атмосферном давлении, либо при повышенном до тех же цифр, что и в опытах с ксеноном. Затем барокамеры помещались в криотермостат (спиртовую баню) при -20°С и выдерживались 2 часа (рис.5), после чего либо сначала охлаждались со скоростью ~1,5°С в минуту до -80°С, либо сразу помещались в жидкий азот.
В дальнейшем барокамеры помещались в пенопластовые термоконтейнеры, крышки с них быстро снимались, на криопробирки в стерильных условиях навинчивались захоложенные в жидком азоте крышки, и пробирки переносились в криохранилище (рис. 6).
Для размораживания криопробирки доставались по одной и быстро нагревались в водяной бане при +37°С до растворения льда/клатрата. Выживаемость клеток определялась методом дифференциального окрашивания трипановым синим.
Результаты. Как показали эксперименты, ни резкая декомпрессия с активным пенообразованием, происходящая при таянии клатрата, ни сами методы охлаждения на выживаемость дрожжей практически не влияли – при условии сохранности содержимого в процессе. Результаты оказались весьма обнадеживающими: для дрожжей ксенон обладает криопротекторным эффектом при всех опробованных парциальных давлениях (от 3 до 7 ат) – по крайней мере, не меньшим, чем глицерин или диметилсульфоксид. Впрочем, даже без каких-либо криопротекторов выживаемость дрожжей тоже весьма неплоха – в среднем порядка 35±6%, в то время как и 5%, и 10% глицерин дают выживаемость порядка 50±25%. Что интересно, повышение давления как воздуха, так и чистого азота до 6 ат на процент выживаемости никак не влияло. Выживаемость дрожжей при 6 ат ксенона составила 68,5±6%. Совместное применение ксенона с добавлением в культуральную среду 5% глицерина или диметилсульфоксида с ксеноном синергетического эффекта, к сожалению, не дало. Выживаемость оказалась в среднем 71±15%, что укладывается в пределах погрешности, оказавшейся в наших экспериментах довольно большой из-за относительно малой выборки.
Литература
1. Abraini, J. H., H. N. David, et al. (2005). “Potentially neuroprotective and therapeutic properties of nitrous oxide and xenon.” Annals of the New York Academy of Sciences 1053: 289-300.
2. Boswell, R. (2009). “Is Gas Hydrate Energy Within Reach?” Science 325(5943): 957-958.
3. Breierova, E. and A. Kockova-Kratochvilova (1992). “Cryoprotective effects of yeast extracellular polysaccharides and glycoproteins.” Cryobiology 29(3): 385-390.
4. Claussen, W. F. (1951). “Suggested Structures of Water in Inert Gas Hydrates.” The Journal of Chemical Physics 19(2): 259-260.
5. Derwall, M., M. Coburn, et al. (2009). “Xenon: recent developments and future perspectives.” Minerva anestesiologica 75(1-2): 37-45.
6. Greene, A. E., B. H. Athreya, et al. (1970). “The effect of prolonged storage of cell cultures in dimethyl sulfoxide and glycerol prior to freezing.” Cryobiology 6(6): 552-555.
7. Hecker, K., J. H. Baumert, et al. (2004). “Xenon, a modern anaesthesia gas.” Minerva anestesiologica 70(5): 255-260.
8. Kaiho, K., T. Arinobu, et al. (1996). “Latest Paleocene benthic foraminiferal extinction and environmental changes at Tawanui, New Zealand.” Paleoceanography 11(4): 447-465.
9. Kopeika, J., E. Kopeika, et al. (2003). “Studies on the toxicity of dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, methanol and glycerol to loach (Misgurnus fossilis) sperm and the effect on subsequent embryo development.” Cryo Letters 24(6): 365-374.
10. Kornetov, N. A., M. N. Shpisman, et al. (2002). Application of medicinal xenon narcosis in complex therapy of abstinence syndrome in opiate addiction (in Russian).
11. Lewis, J. G., R. P. Learmonth, et al. (1994). “Cryoprotection of yeast by alcohols during rapid freezing.” Cryobiology 31(2): 193-198.
12. Pauling, L. (1961). “A molecular theory of general anesthesia.” Science 134(3471): 15-21.
13. Petzelt, C., P. Blom, et al. (2003). “Prevention of neurotoxicity in hypoxic cortical neurons by the noble gas xenon.” Life sciences 72(17): 1909- 1918.
14. Prehoda, R. W. (1969). Suspended Animation: The Research Possibility that May Allow Man to Conquer the Limiting Chains of Time, Chilton Book Company.
15. Rodin, V. V., F. S. Isangalin, et al. (1984). “Structure of protein solutions in a presence of xenon clathrate.” Cryobiology & Cryo-Medicine 14: 3-7.
16. Rowe, A. W. and L. L. Lenny (1980). “Cryopreservation of granulocytes for transfusion: studies on human granulocyte isolation, the effect of glycerol on lysosomes, kinetics of glycerol uptake and cryopreservation with dimethyl sulfoxide and glycerol.” Cryobiology 17(3): 198-212.
17. Shcherbakov, P. V., V. I. Tel’pukhov, et al. (2004). Method for Organs and Tissues Cryoconservation In Situ.
18. Sheleg, S., H. Hixon, et al. (2008). “Cardiac Mitochondria l Membrane Stability after Deep Hypothermia using a Xenon Clathrate Cryostasis Protocol - an Electron Microscopy Study.” International Journal of Clinical and Experimental Pathology 1(5): 440-447.
19. Sloan, E. D. (2003). “Fundamental principles and applications of natural gas hydrates.” Nature 426(6964): 353-363.
20. Stackelberg, M. v. and H. R. Mьller (1951). “On the Structure of Gas Hydrates.” The Journal of Chemical Physics 19(10): 1319-1320.
21. Weber, N. C., O. Toma, et al. (2005). “The noble gas xenon induces pharmacological preconditioning in the rat heart in vivo via induction of PKC-epsilon and p38 MAPK.” British journal of pharmacology 144(1): 123-132.
