Криобиология: Изучение жизни и смерти при низких температурах
Автор: Грегори Фэй (Gregory M. Fahy), PhD
Криобиология — наука, которую обычно представляют себе как изучение влияния температур ниже 0ºC на живые организмы, находится на стыке физики и биологии. Физические принципы, на которых основывается криобиология — всеобщи, что делает эту область исследований несколько более стройной, но живой мир скрывает в себе множество сюрпризов и неожиданных ходов, что добавляет бесконечное очарование.
В этом достаточно кратком обзоре мы в первую очередь рассмотрим, что происходит с живыми организмами при температуре ниже нуля градусов Цельсия, но важно сразу отметить, что криобиология охватывает весь спектр биологических исследований при низких температурах, в том числе — и выше нуля. Формально, криобиология, на самом деле, изучает живые системы при какой-то температуре ниже стандартного физиологического диапазона. Это включает, например, гипотермию у человека (как преднамеренно вызванную, так и случайную) и даже естественную спячку у животных, которая есть некая физиологическая разновидность сна и которая позволяет таким животным расширить физиологический температурный диапазон, включая температуры, которые были раньше смертельными. Низкие температуры выше нуля могут быть такими же смертоносными, как и температуры ниже нуля, что обязательно нужно учитывать в экологии и земледелии.
Вот некоторые темы для криобиологических исследований при температуре ниже 0ºC: природная чувствительность или, наоборот, устойчивость растений, насекомых и позвоночных к морозам; сублимационная сушка, переохлаждение, криохирургия, отморожение тканей, и преднамеренное криосохранение клеток, тканей или организмов.
Чувствительность и устойчивость организмов к холоду
Одна причина того, что природная криобиология так интересна — это то, что природа уже имела миллионы лет для того, чтобы приспособить организмы к стрессам от низких температур. Понимание того, как природа смогла согласовать друг с другом законы физики и биологии, может открыть множество новых горизонтов.
Существуют, например, деревья, ветки которых сохраняют жизнеспособность после погружения в жидкий азот, если они были перед этим специально подготовлены. Оказывается, что такой способностью они обладают благодаря тому, что они вырабатывают специальные белки и сахара, в присутствии которых цитоплазма переходит в стеклообразное состояние при температурах от -30 до -40ºC; как только эти растительные клетки витрифицируются, они становятся невосприимчивыми к большинству низкотемпературных отклонений. Некоторые лишайники демонстрируют ещё более невероятные способности: они целиком витрифицируются при охлаждении и нагревании, не образуя перед этим кристаллов льда.
Другой, даже более выдающийся пример — это определенный вид лягушки, способный выживать после замерзания. Это позвоночное, как и некоторые черепахи, змеи и саламандры, нашли способ подготавливать все их внутренние органы к сильному промерзанию при относительно высоких температурах (около -6ºС) в течение недель и с самопроизвольным восстановлением, когда наступит оттаивание.
Как оказывается, главные элементы успеха этих существ есть выработка природных криозащитных агентов (особенно глюкозы и глицерина, а также множества других менее значительных веществ) и способности контролировать, где будут образовываться кристаллы льда — так, что они скорее образуются не внутри, а снаружи основных органов. Некоторые растения также способны локализовывать образование кристаллов льда, образуя преграду между самыми чувствительными их частями (такими, как апикальные меристемы), и местами образования кристаллов льда, так, что вода уходит из меристем и замерзает в местах, где образование кристаллов безопасно. При этом кристаллы, разрастаясь, не могут преодолеть преграду и уничтожить меристему. Меристема способна пережить обезвоживание, и таким образом она и переживает зиму.
Настоящими чемпионами по природной выживаемости при низких температурах (не считая бактерий и других подобных организмов), вероятнее всего, будут насекомые. Некоторые из них способны выживать после замораживания, по крайней мере, до температуры сухого льда (-79ºC). Существуют рассказы о насекомых, которые медленно переваривают пищу, будучи замороженными в течение многих недель, и «предпочитающих» оставаться замороженными скорее, чем оттаивать. Их мозги также производили вызванные потенциалы, когда их глаза подвергались освещению при температуре -20ºC, и они были также способны переохлаждаться (остывать, не замерзая, до температур ниже нуля) настолько, насколько это вообще позволяют физические свойства воды.
С другой стороны, многие насекомые также вырабатывают белки, позволяющие им замерзать при как можно более высокой температуре при охлаждении. Другие же вырабатывают белки с «антифризными» свойствами, которые не позволяют кристаллам льда расти в их теле даже тогда, когда температура самого тела ниже их точек замерзания, а внутри тела уже есть лёд! Животные, наиболее известные выработкой белков-«антифризов» — это рыбы, живущие в приполярных широтах, частично благодаря тому, что для этих достаточно массивных рыб жизнь при температуре примерно на 1 градус ниже точки замерзания — это обычные условия. Но насекомым всё же удалось развить эту способность гораздо лучше. Что интересно, о физических механизмах выживания насекомых при низких температурах известно меньше, чем о подобных механизмах у других организмов, устойчивых к холоду.
Сублимационная сушка
Изредка сообщалось, что сублимационная сушка давала жизнеспособные клетки. Мериман докладывал, что бычьи сперматозоиды выжили после сублимационной сушки, но этот опыт успешно повторить не удалось. Компания LifeCell Corporation изобрела технологию сублимационной сушки с витрификацией: сначала клетки охлаждаются так быстро, чтобы кристаллы льда не успели образоваться, или чтобы образовавшиеся кристаллы были слишком малы, чтобы повредить клетки, а затем они помещаются в вакуум, близкий по плотности к космическому, чтобы испарить всю воду при очень низких температурах. После того, как эти клетки затем побудут небольшое время при комнатной температуре, их можно будет вновь насытить водой, после чего они, будто бы, могут восстановить свои жизненные функции. Но делиться эти клетки уже не смогут.
Наилучшие результаты сублимационная сушка даёт с бактериями и другими прокариотами, и в определение оптимальной среды для выживания при заморозке было вложено много усилий.
Существование ангидробиотических организмов, которые, как можно понять из их названия, выживают даже при почти полном обезвоживании в незамороженном состоянии, позволяет серьёзно рассматривать сублимационную сушку как возможную и более удобную альтернативу хранению в жидком азоте. Самые известные организмы в этой группе — это, наверное, тихоходки, так как по строению тела они достаточно сложны: у них есть голова, конечности и внутренние органы, похожие на органы многих насекомых. Оказывается, что их выживание без воды становится возможным в большой степени благодаря выработке специального сахара — трегалозы, строение молекулы которой как раз такое, которое позволяет сохранять структуру мембраны, связываясь с полярными головками липидов вместо воды; также, согласно данным некоторых лабораторий, трегалоза работает и как криопротектор.
Переохлаждение
Как уже было сказано, способность многих рыб и насекомых не замерзать, когда всё их тело охлаждается до температуры ниже нуля, позволяет им пережить зиму. Как ни удивительно, той же способностью обладают и некоторые млекопитающие, в том числе летучие мыши и один очень хорошо приспособившийся вид суслика, живущий на Аляске. Его тело может остывать до -3ºC во время спячки и не замерзать, несмотря на то, что его кровь обычно замерзает при температуре несколько выше -0,6ºC, что было установлено замораживанием образцов и использованием осмометра.
Переохлаждение в последнее время стало основой работы британской компании «Pafra, Ltd», которая сохраняет энзимы и даже целые клетки, охлаждая их в крошечных капельках воды при температурах несколько градусов ниже температуры их замерзания. Поскольку вероятность спонтанного замораживания в таких маленьких объёмах мала, и поскольку капельки не могут соприкасаться, будучи распылены в неводной фазе как эмульсия, стабильное переохлаждение большой величины (к примеру, от -10 до -20 градусов С) можно поддерживать в течение месяцев. Это позволяет получать низкие температуры без повреждений, вызываемых замораживанием. Переохлаждение может приводить к денатурации ферментов, так как охлаждение ослабляет гидрофобные взаимодействия, которые вызывают сворачивание белков и самосборку мембран, однако такая денатурация при повышении температуры белков обычно быстро и спонтанно возвращается к первоначальному состоянию.
Были попытки использовать переохлаждение для сохранения органов млекопитающих, но время хранения при этом оказалось не выше, чем у технологии хранения при плюсовых температурах, возможно, частично вследствие таких факторов, как белковая денатурация, что приводит к возникновению «холодовых травм», повреждений, связанных с непосредственно охлаждением как процессом. Переохлаждение – это также основа витрификации органов, тема, которую затронем ниже.
Криохирургия
Криохирургия считается разделом криобиологии, даже невзирая на то, что целью криохирургии является скорее убийство клетки, чем их сохранение. При криохирургических процедурах клетки пациента подвергаются очень быстрому охлаждению до низких минусовых температур. Быстрое охлаждение, в силу основных физических причин, вызывает замораживание воды внутри клеток, в то время как медленное охлаждение, которое встречается в природе и обычно используется для криоконсервации, приводит к тому, что внутриклеточная вода выходит из клетки и замерзает снаружи. Внутриклеточное замерзание, как правило, приводит к смерти, и опасность летального исхода усиливается при медленном нагревании, которое позволяет внутриклеточному льду образовать более простую структуру, в процессе чего происходит буквально перемалывание внутренней части клетки. Криохирургия использует локализованное быстрое охлаждение до смертоносных температур, после чего производится относительно медленное подогревание, и это применяется для уничтожения не желаемых клеток, таких как раковые клетки.
Основное преимущество криохирургии – криоиммунология, то есть стимуляция иммунной системы за счёт высвобождения целевых клеточных антигенов в результате повреждений или лучшего их подведения в механизмах иммунного контроля. Благодаря криохирургии было достигнуто резкое уменьшение сопротивления раковых клеток в сравнении с традиционной хирургией, и новая компания «CryoMedical Sciences» разработала отличную новую технологию криохирургии, которая в этом плане будет иметь большую значимость.
Обморожение
Разновидность медленного замораживания, которое может так же приводить к летальному исходу, как и криохирургия, - отмораживание конечностей в результате ненамеренного охлаждения. Здесь кристаллы остаются за пределами клетки, но вследствие отсутствия криозащитного вещества, степень замораживания превосходит допустимые пределы. Повреждения по преимуществу имеют по природе механический характер, но необязательно приводят к омертвению клеток в отмороженной конечности. Это продемонстрировали соответствующие многочисленные опыты. Например, исследователи из Аляски обнаружили, что сильно замороженные конечности часто можно было спасти, с помощью простого способа, надрезав их послойно, для того чтобы скопившаяся отёчная жидкость могла вытечь, после чего конечность голубого цвета без кровообращения при приливе свежей крови может неожиданно порозоветь. Замораживание повреждает кровеносные сосуды, делая их склонными к просачиванию жидкости в соединительную ткань (инстертицию); этот отёк усиливает давление ткани, что ведёт к разрушению извне кровеносных сосудов и останавливает кровоток. Если ослабить давление тканей, достаточное количество крови может вернуться обратно в конечность, что позволит избежать ампутации. Низкой молекулярной декстран также помогает при обморожении предотвращать образование кровяных тромбов, повреждающих сосуды.
Ещё одной серией завораживающих экспериментов было замораживание хомяков исследователем Одри Смит в 50-е годы (общее число 15). Она обнаружила, что 80% воды, содержащейся в их коже, оказалось возможным заморозить без повреждений и что от 50 до 80% воды в конечностях можно превращать в лёд без обморожения при условии, что конечность во время заморозки не была согнута.
Другие аналогичным образом обнаружили, что довольно необычные стрессы при замораживании, в том числе внутренняя температура конечностей от -10ºС или даже -30ºС могут переноситься удивительно хорошо. Опыты, подобные этим, указывающие, что сложные структуры могут выдерживать массовые нарушения целостности, вызываемые кристаллами льда, укрепили уверенность в том, что даже внутренние органы, такие как почки и печень, можно замораживать на длительные периоды времени и восстанавливать для трансплантации.
Криосохранение
Конечно, верно, что организованные ткани, которые не нуждаются в сосудистой поддержке для своего функционирования, можно успешно замораживать и оттаивать. Фактически, трудно представить организованную ткань млекопитающего, которую невозможно успешно заморозить и разморозить при использовании соответствующей техники, и тысячи линий различных клеток находятся в замороженных хранилищах, куда они были помещены исследователями, чтобы в будущем учёные могли воспользоваться ими для своих нужд. Трансплантация ранее замороженных клапанов человеческого сердца, основных кровеносных сосудов и частей колена компания «CryoLife, Inc.» превратила в индустрию с многомиллионными оборотами, и существуют также крупные отрасли промышленности, основанные на сохранении и использовании замороженной человеческой кожи, семени и эмбрионов.
С другой стороны, есть также некоторые клетки у млекопитающих, такие как тромбоциты, гранулоциты и ооциты, которые отличаются большой чувствительностью и которые трудно адекватно заморозить.
Применение для военных нужд, требующее клеток, которые можно замораживать, размораживать и производить трансфузию без удаления криопротекторных добавок, также представляет большие трудности. Далее, очевидно сложно криосохранять определённые виды растительных тканей, а криосохранение некрупных морских организмов часто оказывается в какой-то степени проблематичным вследствие их непереносимости криопротекторов.
Ясно, что в криобиологии многое ещё нужно сделать, и в практическом, и в теоретическом плане, но мне по крайней мне представляется, что самое большая проблема здесь – это криоконсервация органов млекопитающих.
Неправильно утверждать, как многие это часто делают, что в этой области не было достигнуто никакого успеха. Как раз наоборот. Несколько лабораторий уже сообщили о замораживании кишечника собак в жидком азоте с последующим восстановлением после размораживания, хотя очевидными были множественные повреждения и успех зависел от основной регенерации и самовосстановления в сочетании с выносливостью к серьёзным сосудистым повреждениям. Печени частично восстанавливали функционирование после замораживания до – 60С, селезёнки и мочеточники собак перенесли глубокое замораживание и трансплантацию, а лёгкие перенесли основные перегрузки замораживания при очень низких минусовых температурах. Постоянно поступали сообщения, что даже сердце и почки переносили частичное замораживание, но не перенесли достаточно сильное замораживание при длительном сохранении. Проблема - это вопрос степени: частичный успех не может быть полезной заменой успеха полного.
Факт, что природа, как представляется, подсказывает нам, что образования льда по возможности лучше всего избегать, и дано, что наличие хорошо задокументированного физического повреждения неживых соединительных тканей, обнаруженных в органах, которое разрушает капилляры и межклеточные связи так, что органы перестают функционировать, независимо от того, содержат они живые клетки или нет, для решения проблемы представляется логичным скорее нацеливаться на витрификацию, чем на замораживание. Витрификация включает в себя чрезвычайное повышение вязкости при охлаждении, что в конечном результате приводит к образованию такой жидкости, в которой точно так же отсутствует внутреннее движение (конвенция), как в твёрдом кристаллическом веществе, и таким образом такая жидкость не может со временем измениться, и однако в кристаллической структуре недостаёт молекулярных перегруппировок, что приводит к большим повреждениям.
Я уже работаю над этим подходом с конца 80-х годов прошлого столетия, и каждый год, прошедший с того времен, принёс новые важные улучшения в достижении этой цели. В начале 1995 года, спустя более 14 лет усилий есть ещё больше оснований продолжать надеяться, что эта проблема может быть решена. Результатом могли бы стать не только победа над продолжительной научной проблемой, но и значительное продвижение в трансплантационной медицине.
Криобиология в будущем
В моей карьере криобиолога я нашёл возможность добавить новое измерение к физике криобиологии, установив практические методы по устранению кристаллов льда. Когда-нибудь появятся другие дополнительные измерения вследствие изменения физики льда фундаментальным способом. Способность управлять как физическим, как и биологическим аспектами живых систем в процессе охлаждения и размораживания после криогенных температур гарантирует, что криобиология в будущем будет в течение какого-то времени оставаться полем для активных исследований. Даже после того, как будут изучены возможные в настоящее время манипуляции в области физики и биологии, на сцену выйдут нанотехнологии, что позволит кому-то приступить к исследованиям в этой сфере с совершенно нового ракурса и изменит правила игры более радикально, чем это могут себе представить большинство живущих сегодня криобиологов.
Криобиология очевидно с уверенностью смотрит в своё будущее.
Перевод: Елена Василевская, Андрей Копылов
