Проблемы долгосрочного холодового хранения мозгов пациентов для доставки в Институт Крионики (США)

 

Часть 1. Экспериментальное исследование ишемии мозговых тканей 

Процедура перфузии мозгов пациентов с витрифицирующей смесью (ВС) является более сложной, чем глицериновая процедура, и поэтому она может быть осуществлена только в Институте Крионики (ИК). Некоторые аргументы для осуществления ВС перфузии: в похоронном бюро сотрудники не могут осуществлять новую хирургическую процедуру, которая идеально подходит для перфузии мозга. Для метода перфузии с витрифицирующей смесью используется 5-7 девятилитровых канистр с витрифицирующими растворами. Обычно похоронные бюро не имеют холодильников для хранения этих емкостей. Однако главная проблема заключается в возможной кристаллизации льда в перфузированных мозгах пациентов с витрифицирующими растворами в течение 24-48 часов транспортировки в сухом льде при -79°С. Согласно моим экспериментам, мозговые ткани крысы, которые были полностью насыщены 65% ВС-1 могут храниться при температуре сухого льда в течение, по крайней мере, 48 часов без уменьшения их жизнеспособности после их криоконсервирования. Итак, ИК мог бы транспортировать их пациентов, мозги которых были насыщенны 65% ВС-1 в сухом льде, например, из Англии в США в течение 48 часов. Однако, ИК так же, как и Алькор, не имеет надежных методов определения полного насыщения всех областей человеческого мозга с конечной концентрацией верифицирующих смесей. Таким образом, ИК решил транспортировать неперфузированных пациентов в обычном льде при температуре 0-4°С.

Какие биологические изменения происходят в человеческих мозговых тканях в течение долговременного холодового хранения при температуре 0-4°С?
Кто-то может задать вопрос, почему не может функционировать человеческий организм при низкой температуре подобно организму лягушки. Люди теплокровные животные (homo terma), и поэтому человеческий мозг не может нормально функционировать при температуре ниже 36,6°С. Мозги холоднокровных животных (poli terma) такие как рептилии, насекомые, амфибий и рыбы могут функционировать при низкой температуре вплоть до 0°С.
С некоторыми исключениями все млекопитающие и птицы есть теплокровные. Некоторые теплокровные животные, такие как медведи, суслики, летучие мыши, гибернируют в течение холодной зимы. В течение гибернации эти животные могут опускать температуру тела так низко, как 35-39°С. Однако «гибернаторы» могу иметь холодовую устойчивость только в гибернирующей стадии в отличие от хладнокровных животных. Гибернирующие животные в активной, не гибернирующей стадии являются холодочувствительными, так же как и не гибернирующие животные.
Бен Бест (президент ИК) писал о состоянии мышей, подобным состояниям остановленной жизни, что может индуцироваться сероводородным газом (H2S), в его статье «сероводород для крионики» (The Immortalist, v. 37, No.7-8, p. 14, 2005). Я пишу об этих экспериментах по тестированию сероводорода, используя крысиные мозги ниже. Может ли сероводород индуцировать гибернационное состояние для негибернирующих животных?
Переход от активного состояния к гибернирующему состоянию, контролируется генами, которые негибернирующие животные не имеют. Мозговые ткани гибернирующих животных постепенно изменяют их микроструктуру и биохимию для того, чтобы иметь состояние гибернации. Негибернирующие животные не будут способны иметь состояние гиберации даже, если им будут вводить специфические гормоны, потому что они не имеют специфических генов. Сероводород или какие-либо другие вещества не могут производить состояние гибернации для негибернирующих животных.

Я привожу некоторые специальные статьи о хорошей холодовой резистентности (сопротивляемости) мозговых тканей и мозгов гибернирующих животных.
1. Neuroscience 1990;38(3):591-608. Спонтанная и вызванная нейрональная активность была исследована экстрацелюлярно (внеклеточно) в срезах, взятых из мозга трех групп животных: гибернирующих сусликов, также бодрствующих сусликов и морских свинок. Различая между активными и гибернирующими сусликами были сохранены в течение возобновленного тестирования после глубокого и продолжительного охлаждения срезов. Эксперименты продемонстрировали стабильную активность нейронов у гибернирующих сусликов.
2. Brain Res Bull 1994;33(6):719-21. Эта статья описывает приготовление изолированного мозга гибернирующих сусликов, который сохранялся путем интертелиальной перфузии. Эта технология позволяет сохранять выживание изолированного мозга взрослых животных на длительное время (около трех дней). Жизнеспособность была оценена путем внеклеточного изучения стабильности структурноспецифической и электрической активности.

Доктор Пахотин и другие описали интересные экспериментальные находки в Neuroreport, 1997, May 6;8(7):1755-9. Обработка мозговых срезов морских свинок (это негибернирующее животное) с аспирином или индомецином позволила им пережить глубокую гипотермию в течение целой ночи. 
Я старался проверить эти данные, используя срезы гиппокампа крыс. Однако я не получил положительного эффекта индомицина или аспирина на срезах при 2-4°С в течение 12 часов. И нет статей, в которых позитивный эффект этих веществ был найден другими исследователями. Смотрите результаты моих экспериментов с холодовым хранением мозговых срезов крыс ниже в этой статье. Это было невероятно, если бы люди имели состояние гибернации после принятия некоторого количества аспирина.
Давайте прямо рассмотрим предмет экспериментального изучения ишемии мозговых тканей. Ишемия это ограничение кровяного снабжения. В крионике мы обычно имеем дело с полной ишемией, то есть полным отсутствием какого-либо кровоснабжения тканей. Институт крионики мог использовать только крыс для экспериментов. Я иногда использовал свежие головы мертвых овец из местной скотобойни. Я напоминаю, ИК не использует живых крыс в эксперименте, но использует очень свежие тела мертвых крыс. Крысы были убиты дополнительным количеством анестетика изофурена под очень глубокой анестезией. Итак, они не могли чувствовать какой-либо боли в этой процедуре умерщвления. Я не старался реанимировать мертвых крыс как целые организмы, я пытался реанимировать, восстановить только мозговую ткань крыс, а именно тонкие срезы гиппокампа. Согласно современной нейрофизиологии тонкие мозговые срезы могут быть полностью восстановлены ин витро. Технология мозговых срезов может быть использована для оценки выживания и целого мозга.
K+/Na+ аналитический тест (тест по анализу отношения K+/Na+) наиболее приемлемый метод оценки мозговых тканей для института крионики, потому что он простой, надежный, недорогой и, в то же время, чувствительный функциональный метод. Однако этот метод не может различать жизнеспособность нейронов от жизнеспособности глиальных клеток. Может быть оценено только общая, суммарная клеточная выживаемость, а для того, чтобы оценить выживаемость нейронов, необходимо использовать электрофизиологические методы. Но электрофизиологическое оборудование не было доступно для ИК.
Живые клетки внутри имеют больше ионов К+, чем снаружи и больше ионов Na+ снаружи клеток, чем внутри. Это динамическое равновесие есть результат работы ионных насосов и целостности клеточных мембран. Концентрации этих и других ионов внутри и вне клеток становится равными, когда клетки мертвые. Живые клетки гиппокампа крыс 0,445 мм толщиной имеют среднее значение K/Na равное 3,0±0,4 (это безразмерная величина), согласно стандартному K/Na тесту. Полностью мертвые срезы имеют 0,1 K/Na. Величина K/Na мозговых срезов пропорционально количеству живых клеток в срезе, и поэтому это может быть количественным индикатором выживаемости клеток.
Данные по выживаемости мозговой ткани после продолжительного времени тепловой и холодовой ишемии, которые были бы получены функциональными оценочными методами, практически отсутствуют в научной литературе и поэтому изучение ишемии мозговой ткани актуально для криобиологии и крионики.

1. Изучение тепловой ишемии мозговых тканей крыс.
Я представляю результаты своих экспериментов в сравнении с результатами экспериментов доктора Леонарда (рис.1). Заглавие статьи д-ра Леонарда есть «Влияние после смертного периода на вызванные фокальные потенциалы гиппокампа ин витро приготовленых срезов (Exp Neurol 1991 Sep;113(3):373-7). Термин «после смертный» период имеет тот же смысл, что и «полная ишемия». Мозги от девятимесячных крыс выдерживались при комнатной температуре в течение периодов тепловой ишемии 5, 30, 60, 90, 120 или 180 минут перед приготовлением срезов гиппокампа. Экспериментальные условия для ИК экспериментов были очень близки к экспериментам доктора Леонарда, но крысы были намного моложе (двухмесячные крысы).

Рисунок 1. Зависимость жизнеспособности (viability) мозговых тканей крысы от временных периодов тепловой ишемии (time)
Объяснение:

1 - ИК эксперименты 
2 - Д-ра Леонарда эксперименты (я представляю данные для CA региона из вышеупомянутой статьи стр. 375, рис 3. Процент срезов с амплитудой популяционного спайка больше, чем 1 млВ (вызванной приблизительно половиной максимальной интенсивности стимула) как функция аноксической задержкой (период прекращения дыхания поступления кислорода).

Рис.1 показал более высокую выживаемость в ИК экспериментах, чем выживаемость в экспериментах д-ра Леонарда. Может быть, возраст крысы мог играть определенную роль. Более молодые мозговые ткани являются более устойчивыми к вредным факторам, чем ткани старых крыс. Однако д-р Леонард и я использовали различные методы оценки жизнеспособности.
Результаты моих экспериментов показали общую клеточную выживаемость в срезах гиппокампа крысы, согласно K/Na тесту. Результаты д-ра Леонарда отражают выживаемость нейронов, но исследователи использовали необычный метод выражения жизнеспособности. Авторы этой статьи писали «жизнеспособность была определена как количество мозговых срезов, из которых популяционный спайк, по крайней мере, 1 млВ мог быть вызван» (стр. 734). Обычно электрофизиологи определяют нейрональную жизнеспособность или выживаемость в определенных областях среза, как величину зафиксированного популяционного спайка, что была разделена на средний контроль популяционный спайка и выраженная в процентах. Например, если зарегистрированный популяционный спайк в СА регионе был 1 млВ и средний популяционный спайк в CА регионе контрольного среза был 2 млВ, значит, жизнеспособность среза была 50% от контроля.
Доктор Леонард выражал жизнеспособность не как процент выживших нейрональных клеток в определенной области среза гиппокампа крысы, но как процент срезов с более чем 50% нейронной жизнеспособностью. Этот метод оценки жизнеспособности есть более ограниченный метод, и он может дать некоторую недооцененную жизнеспособность в сравнении с обычным методом. Д-р Леонард использовал этот метод, потому что его главной задачей было выяснить, какое число срезов могло бы быть использовано для электрофизиологических экспериментов после различных временных периодов тепловой ишемии. Эти исследователи сделали вывод, что результаты их опытов означают, что период задержки между смертью мозга крыс и приготовления ин витро срезов гиппокампа в некоторой степени менее важно для получения физиологических жизнеспособных срезов, чем полагали раньше. Эти данные так же подразумевают, что значительная электрофизиологическая информация о досмертных условиях, в которых мозг находился, может быть получена из нервной ткани, которая недоступна сразу после смерти.
Существуют различные методы оценки жизнеспособности мозговой ткани. Ученые выбирают некоторые их этих методов в зависимости от их цели исследования и наличия надлежащего экспериментального оборудования. Следует заметить, что метод регистрации популяционных спайков оценивает живые нейроны именно в нейрональной сети. Например, если мы блокируем синаптическую активность во всех живых нейронах всех регионов какого-то среза гиппокампа то, K-Na тест, так же как и методы оценки, путем прижизненного окрашивания, покажут 100% выживаемость или жизнеспособность среза, но метод популяционного спайка продемонстрирует 0% жизнеспособности этого среза, потому что живые нейроны не могли функционировать как нейрональная сеть.

2. Изучение холодовой ишемии ткани крыс.
Большинство ИК пациентов живет вне штата Мичиган и поэтому их следует транспортировать в Институт Крионики для криоконсервирования методом витрификации. Временной период транспорта потенциальных пациентов в ИК может быть 12-24 часа и более для пациентов вне США. Итак, важно изучить 12-48 часовую холодовую (0-4°C) ишемию мозговых тканей.
В этой серии экспериментов я старался избежать тепловой ишемию полностью для того, чтобы изучить именно влияние холодовой ишемии на выживаемость мозговых тканей крысы. Было два типа экспериментов:
1. Крысиные мозги, которые не были обработаны с какими-либо веществами. Для того чтобы избежать вредного действия тепловой ишемии, мозги были очень быстро, в течение минуты, удалены из черепа, погруженного в холодный физиологический раствор, и охлаждены в этом растворе при температуре 2-4°С. Затем мозги были помещены в пустые пробирки и хранились при 2-4°С в течение 3-48 часов.
2. Верхние части крыс были быстро перфузированы с холодным (0°С) аCSF через аорту. Головы крыс были разрезаны и удалённые мозги были помещены в пластиковые мешочки, которые хранились при 2-4°С в течение 3-48 часов. аCSF – это искусственная спинномозговая жидкость, которая обычно используется для инкубирования мозговых срезов.
После холодового хранения срезы гиппокампа были приготовлены из этих мозгов. Клеточная выживаемость в срезах была оценена K/Na тестом. Результаты экспериментов представлены на рисунке 2.

Рис. 2. Зависимость выживаемости мозговой ткани крыс от временного периода холодовой ишемии
1 – выживаемость срезов гиппокампа из необработанных мозгов крыс
2 – выживаемость срезов гиппокампа из мозгов крыс, перфузированных с аCSF раствором при 2-4°С

Рис. 2 показывает, что выживаемость этих срезов от необработанных мозгов крысы в общем, слегка выше, чем выживаемость от крысиных мозгов перфузированных с этим инкубационным раствором.
Мозговые ткани теряют 50% их выживаемости в течение 3х часов тепловой ишемии (рис.1), или в течение 18 часов холодовой ишемии (рис. 2). Итак, тепловая ишемия является в 6 раз более повреждающей для мозговой ткани, чем холодовая ишемия.
Я нашел интересную статью посвященную изучению длительного охлаждения целого мозга с электрическим и метаболическим восстановлением, написанную доктором Уайтом (Nature 1966;209:1320-22). Собачьи мозги были перфузированы с ледяным раствором Рингера - лактоза и хранились при 2°С в течение различного временного периода от 2х часов до 15 дней. «Мозги, которые хранились в течение 2 или 4 часов, мозговая электрическая активность была восстановлена при внутримозговых температурах 22°С и выше. Длительная поддерживающая перфузия отогретого мозга при +34°С в течение более чем 6 часов однозначно показала исчезновение электроэнцефалографической активности и развития необратимого отека. Никакой распознаваемой мозговой электрической активности не было зарегистрировано от мозгов, хранящихся в течение 12 часов и более» (стр.1322).
Итак, почти нормальная электрическая активность собачьих мозгов, которые хранились при 2°С в течение 4х часов, была обнаружена. Это приблизительно от 90 до 80% выживаемости мозгов крыс оцененных методом срезов и K/Na тестом. Следует заметить, что даже после 15 дней охлаждения мозг мог быть перфузирован, но с развитием отека. Я лично перфузировал головы овец с холодными (при 0°С) витрифицирующими растворами после 1-2 часов тепловой ишемии плюс 22-24 часа холодовой ишемии с определенным успехом, то есть без отека головы и тканей мозга.

3. Изучение сочетания тепловой и холодовой ишемии.
Практика крионики показала, что иногда невозможно избежать тепловой ишемии перед охлаждением пациента и транспортировки их при температуре льда. Я старался оценить влияние 0-3 часовой тепловой ишемии мозгов крысы на их выживаемости после холодового хранения до 24 часов. Например, было 2 часа теплового хранения плюс 22 часа холодового хранения. Результаты этих экспериментов представлены на рис. 3.

Рис. 3. Сочетание 0-3-х часовой тепловой ишемии с 24-21 часом холодовой  ишемией для крысиных мозгов

4. Тестирование некоторых растворов для консервации органов на крысиных мозгах и срезах.
Время, при котором органы для трансплантации могут быть сохранены вне тела, варьируют так: для сердца - легкие – это в течение 4-5 часов, сердце в течение 6-8 часов, легкие в течение 12 часов, печень - 12-24 часов и почка в течение 48-72 часов, но нет информации о мозге, так как он не используется для трансплантации. Однако есть хорошо известный факт, что мозговые ткани есть наиболее чувствительные ткани к любым повреждающим вредным факторам.
Я изучил наиболее используемые растворы для сохранения органов такие как Viaspan, или университета Висконси раствор для хранения органов, затем RPS-2 (раствор для сохранения почки) и его видоизменение, затем MHP-2 (маннитол - гидрооксикрахмаловый раствор для перфузии, используемое Марком Дарвином в Алькоре), Renasol H (раствор для хранения почки с гидроксикрахмалом, используемым д-ром Фэием в компании Медицине 21-го века, США) и aCSF - искусственный спинноцеребральный раствор, моделирующий спинномозговую жидкость.

Композиция растворов дана в таблице 1.

Таблица 1. Композиции холодовых растворов

   aCSF   RPS-2   m-v-RPS-2   Viaspan   MHP-2   Renasol H 
 NaCl   124       25     40 
 NaHCO3   26   10   10     10   
 KCl   4   28,5   30   125   28,3   
 KH2PO4   1,4       25     
 K2HPO4*3 H2    7,2         7 
 CaCl2           1,5   1 
 Glucose   10   180   230     5   10 
 Mannitol           170   
 Adenine-HCl     1       0,94   1 
 Adenosine         5     
 Allopurinol         1     
 Chondrioitin             0,1% 
 Sulfate A             0,9 mg/l 
 Chlorpromazine reduced     5     3   3   5 
 Decaglycerol             1,8% 
 Dexamethasone         16 mg/l     16 mg/l 
 HEPES           15   8 
 Tris-HCl       10       
 HES         50 g/l   50 g/l   50 g/l 
 Lactobionic acid         100     
 α-Lactose             45 
 Raffinose         30     
 Ribose           0,94   
 Sodium acetate             2 
 Tripotassium citrate             18 
   aCSF   RPS-2   m-v-RPS-2   Viaspan   MHP-2   Renasol H 

Обычно органы перфузируются с холодными растворами для консервирования органов в течение короткого времени для того, чтобы отмыть их от крови. Непрерывная перфузия органа с растворами более редко используется, но может дать несколько лучшие результаты. Поэтому я использовал срезы гиппокампа крысы для 12 часовой холодовой ишемии для того, чтобы протестировать растворы для предохранения органов в условиях непрерывной перфузии.
Типичная процедура обработки мозгов крыс растворами для предохранения органов. Верхние части крыс были быстро перфузированы с холодовым (0°С) раствором через аорту для сохранения органов. Головы крыс были отрезаны и помещены в пластиковые мешки и хранились при температуре 2-4°С в течение 12 или 24 часов.

Результаты экспериментов с растворами для сохранения органов в таблице 2.

Таблица 2. Результаты экспериментов с растворами для сохранения органов

 Время   12 часов   24 часа 
   Мозг   Срезы   Мозг 
 Необработанные   49±2     48±4 
 Растворы 
 aCSF   59±3   10±2   43±2 
 RPS-2   55±2   84±3   41±3 
 m-v-RPS-2   47±2   78±3   25±2 
 Viaspan   60±3   71±2   40±2 
 MHP-2   53±7   16±2    
 Renasol H   52±5   81±3   

Ни один из растворов не показал положительный результат в течение 24 часового холодового хранения мозгов крыс, которые были перфузированы с растворами в сравнении с необработанными мозгами (контрольными). Некоторые из растворов продемонстрировали очень маленький положительный эффект для 12 часов. Знаменитый Viaspan не был лучше, чем искусственная цереброспинальная жидкость, хотя он намного дороже, чем она. M-v-RPS-2 показал худшие результаты. Однако он использовался ИК в качестве транспортного раствора, но ни в качестве раствора для холодового хранения.
Растворы за исключением искусственной спинномозговой жидкости и MHP-2 показали более высокую выживаемость для мозговых срезов, чем для целых мозгов. Это трудно для меня объяснить, почему эти два раствора дали такие плохие результаты. В прошлом я уже осуществлял подобные эксперименты со срезами гиппокампа крыс, используя искусственную цереброспинальную жидкость, и получил те же плохие результаты. У меня есть две гипотезы для того, чтобы объяснить, почему 4 из 6 растворов в этих экспериментах имели более высокую выживаемость для мозговых срезов, чем для целых мозгов.

Первая гипотеза состоит в том, что непрерывная перфузия могла быть лучше, чем статическое холодовое хранение. Можно ожидать, что мозг крысы, перфузируемый с холодовым RPS-2 в течение 18 часов будет иметь выживаемость близкую к 84% так же, как для мозговых срезов, но не 55% (см. табл. 2). Чтобы поверить эту гипотезу я осуществил эксперименты с периодической перфузией крысиных мозгов с холодным RPS-2 раствором в течение 9 часов их холодового хранения. Результаты этого, 45% выживаемость, были хуже, чем результаты 55% выживаемость – (табл. 2) в течение 12 часов неперфузионного холодового хранения мозгов крыс с RPS-2. Итак, периодическая перфузия не была полезной для того, что бы увеличить выживаемость мозговой ткани.

Автор: Пичугин Ю. И., январь 2006 г.

Авторский перевод с английского с технической помощью Марии Федорковой, оригинал на http://www.cryonics.org/immortalist/january06/pichugin.htm