Криопротектор CI-VM-1 и раствор-носитель, используемые для витрификации.

Перевод английской статьи: Yuri Pichugin, “CI-VM-1 Cryoprotectant and CI-Carrier Solution Used for Vitrification” (специальная авторская редакция 2014 года для сайта "КриоРуса").

Институт Крионики (ИК, по-английски Cryonics Institute  или CI) использует смесь криопротекторов для витрификации мозга крионируемых людей и домашних животных  с августа 2004, когда была сделана первая экспериментальная перфузия собаки одного из членов ИК. Эта витрификационная смесь известна под названием CI−VM−1 (ИК  витрификационная смесь один) и была разработана сотрудником ИК криобиологом кандидатом биологических наук Юрием Пичугиным. Впервые витрификационную смесь применили в Феврале 2005 при витрификации собаки по кличке Тор. На человеке этот раствор впервые применили в августе 2005 при витрификации 69-го пациента ИК.

В августе 2006 года Институт Крионики оформил предварительную заявку на патент для CI−VM−1 в ожидании оформления заявки на полный патент. Несмотря на то, что заявку на патент подготовили, юрист-косультант сообщил, что шансы на получение патента весьма незначительны вследствие коммерческого использования более, чем за 1 год  до подачи предварительной заявки на патент. Он посоветовал сделать публикацию о витрификации и растворе-носителе, разработанных в Институте крионике как меру защиты с тем, чтобы другие возможные патентовладельцы не смогли препятствовать использованию CI-VM-1 Институтом крионики.

Заключительную витрификационную перфузиию пациентов Института Крионики делает, используя 70% раствор CI−VM−1 в растворе-носителе, разработанном также доктором Юрием Пичугиным, который он называл m−RPS−2 (модифицированный ренальный раствор консервирования два).

Примерно 8,3 литров 70% го раствора  CI−VM−1 делается из:

1. 2,83 литров этиленгликоля (3,15 килограмма)
2. 2,83 литра ДМСО (3,14 килограмма)
3. 1,0 литра (9X концентрированный) раствор-переносчик (около одного килограмма)
4. 1,70 литра воды (около 1,7 килограмма)

Точный объем не так важен, так как в данном случае имеется ввиду, что 70% это процентное содержание криопротекторов в общем растворе, основанное на расчете веса: около 6,29 кг криопротекторов (этиленгликоль + ДМСО) в отношении к 8.99 кг полного содержания раствора (пп. 1-4). Это записывается как 70: (w/w).

Раствор-носитель состоит из 20 мМ/л KCl (калия хлорида), 230 мМ/л глюкозы и 10 мМ/л и органического буферного раствора TRIS − HCl. Один литр 9-кратно концентрированного раствора-носителя делается из 19 г  KCl, 372 г глюкозы, 11 г ТРИС [2-Амино-2-(гидроксиметил)аминометан] в 72 мл обычной соляной кислоты HCl, отфильтрованной через 2 микронный фильтр.

Ci-VM-1 не фильтруется.

Определение температуры стеклования (витрификации)  (Tg) CI−VM−1, сделанное компанией "Медицина XX века" дало следующие результаты:

60% (w/w) CI-VM-1 ==> Tg = -123º C

70% (w/w) CI-VM-1 ==> Tg = -121º C

Доктор Пичугин полагает, что комбинация его витрификационного раствора  и раствора-носителя оптимальна и по низкой вязкости, и по минимальным расходам, при этом сохраняется значительная возможность витрификации. Он не придает значение важности агентам с высокой молекулярной массой, таким, как белок, декстраны, HES, PVP и т.д. для обеспечения онкотического давления в перфузии мозга в протоколе Института крионики. Он считает, что эти агенты увеличивают вязкость, что приводит к повышению давления при перфузии и, следовательно, - к повышению времени проведения перфузии.  Более того, высокомолекулярные агенты при использовании их в крионической перфузии не нужны, поскольку при крионировании происходит дегидратация мозга и не происходит отека мозга. В  практике Института Крионики не встречалось сильного отека мозга при применении CI−VM−1 и m−RPS−2.

Для кратковременной перфузии при низкой температуре витрификационными смесями можно (и нужно) обойтись без поддержания онкотического давления. Это было доказано Ю. И. Пичугиным на примере витрификации срезов мозга крыс. Поддержание нормального онкотического давления важно только при длительных перфузиях органов для медицинских целей.

Доктор Пичугин обратил внимание, что добавление компонентов, таких как Ca2+, Mg2+, фосфат-ион и неорганический буфер в раствор-носитель имеет результатом появление осадка в CI−VM−1 (так называемое высаливание солей). С учетом того, что витрификационная смесь используется при низкой температуре, может произойти во время перфузии блокирование кровеносных сосудов частичками осадка солей. По этой причине данные компоненты не включены в его раствор-носитель.

Доктор Пичугин дал оценку блокаторам  льда (Supercool X-1000 и Supercool Z-1000) из компании «Медицина XX века», чтобы определить возможную пользу от добавления этих агентов в CI−VM−1. Опыты проводились по методике компании "Медицина XX века"

Сначала он определил, что при замораживании до -130 ºC (и нагреве) со скоростью 0.3ºC/мин минимальная (критическая) концентрация CI−VM−1, требуемая для витрификации без блокаторов льда  равна 55% . При этом 52% CI−VM−1 без блокаторов имеет результатом кристаллы льда.

Затем доктор Пичугин определил, что при замораживании до -130 ºC (и нагреве) со скоростью 0.3ºC/мин минимальная (критическая) концентрация CI−VM−1, требуемая для витрификации с блокаторами льда равна 52% . 50% CI−VM−1 с блокаторами образует кристаллы льда.

Очевидно, что если с помощью блокаторов  можно использовать несколько меньшее процентное содержания криопротекторов в CI−VM−1 для того, чтобы достигнуть такой же витрификации, что и при 70% растворе CI-VM-1 но без блокаторов, то результатом будет повышенная жизнеспособность за счет снижения токсичности, связанной со сниженной концентрацией криопротектора. В отличие от криопротекторов, блокаторы льда не считаются токсичными.

Результаты тестов на токсичность были следующими:

86,1% жизнеспособность +/- 5,8% для 55%-ной концентрации CI-VM-1 без блокаторов льда

89,6% жизнеспособность + / - 6,2% для 52%-ной концентрации CI-VM-1 с блокаторами льда

Анализ токсичности сделали, используя соотношения калия/натрия. Полная жизнеспособность (без токсичности) будет 100%. Отметим ещё раз, что это не проверка способности CI-VM-1 (с блокаторами льда или без них) предотвратить замораживание.

Доктор Пичугин не считает, что данное увеличение повышенной жизнеспособности при добавлении в CV-VM-1 данных блокаторов льда оправдывает получаемое в результате этого увеличение вязкости или серьезные финансовые затраты на добавление данных блокаторов льдообразования в формулу CI−VM−1. Также заметим, что блокаторы льда не проходят сковзь клеточную мембрану или гематоэнцефалитический барьер (ГЭБ). Если участки мозга плохо перфузированы (из-за увеличенной вязкости растворов), то при таких условиях блокаторы льда не помогут достичь витрификации этих участков.Также заметим, что замораживание в клетках не самая большая проблема при крионировании, потому что внутри клеток находится не слишком много нуклеаторов. А вот  нуклеаторов межклеточной жидкости (между клетками) может быть так же много, как и в крови, то есть, очень много. По этой причине факт, что блокаторы льда не проходят клеточную мембрану и гематоэнцефалитический барьер может означать, что перфузия растворами с добавленными блокаторами и меньшей концентрацией основных криопроекторов  при увеличенной вязкости может приводить к худшим результатам, чем перфузия с обычным содержанием растворов и без добавления блокаторов.

Институт Крионики использует криопротекторы промышленного класса, цена на которые довольно низкая. Но, несмотря на промышленный класс, тем не менее, криопротекторы  обладают высокой степенью чистоты. ДМСО чист на 99.7%, его примеси, перечисленные в списке, это только вода, «пигмент» и титриуемая кислотность (0.001 метилэквивалентов/грамм). Этиленгликоль чист на 99.94%, в нем главная примесь - опять же вода: почти 0.06%. Следующие по величине примеси в этиленгликоле это уксусная кислота (<0.001%) и зола (0.0005%). В этиленгликоле находится одна миллионная доля количества  хлорида, «пигмента», диэтиленгликоля и железа.

Протокол Институт крионики для перфузии голов (мозгов) пациентов является 4-ступенчатой открытой схемой перфузии:

1. вымывание крови с раствором-носительем (используется также термин растовр-переносчик) (4 ° С)
2. 10% этиленгликоля (4° С)
3. 30% этиленгликоля (4° С)
4. 70% CI-VM-1 (-7 º C)

После шага №3 с каждой стороны черепа росверливается трепанационное отверстие. Отверстия примерно 1/8 дюйма в диаметре и идут вглубь только чтобы добраться до мозга без его повреждения. Под действием криопротектора мозг сжимается. Обычно трепанационные отверстия в крионике нужны для контроля за отеком или промыванием крови в мозге.

Институт Крионики также применяет трепанационные отверстия и вытекающий поток из яремной вены как средство доступа для контроля концентрации витрификационной смеси в мозгу. Во время перфузии обработанные образцы оттока извлекают из трепанационного отверстия и яремной вены для анализа с помощью рефрактометра.

Цель – перфузировать мозг до тех пор, пока рефракционный индекс образцов венозного потока и трепанационного отверстия не будет, по меньшей мере, соответствовать рефракционному индексу 60% CI-VM−1. Рефракционный индекс 65% раствора CI-VM−1 равен 1.422, а рефракционный индекс 60%  CI-VM−1 равен 1.416. Раствор 60% СI-VM−1 считается соответствующим стабильной витрификации.

Перфузию тела делали с этиленгликолем, а сейчас только с глицерином. Полное описание перфузии Института Крионики и протокол охлаждения можно найти в схеме процедур крионирования ИК и в отчетах, таких как ответ о перфузии 77-го пациента Института Крионики.

Детальноые описания подготовки раствора-носителя и криопротектора можно найти в документе "Комментарии по подготовке раствора".

Ниже находится электронный микроснимок  ткани коры головного мозга крыс, которую перфузировали по пошаговому протоколу 10% этиленгликоля, 30% этиленгликоля и 70% CI-VM−1, охладили до -130 ºC (ниже температуры витрификации), нагрели и отмыли от криопротекторов.  Модификаторы гематоэнцефалического барьера не использовались. Все образцы увеличены в 6000 раз. Белые точки на изображениях предполагают, что артефакты или липидные капли обрабатываются (белые точки выглядят на всех контрольных слайдах так же, как на экспериментальных).

Электронные микрофотографии тканей головного мозга витрифицированные с 70% Ci-VM-1.

Опубликовано: Cryonics Institute. 2007. Retrieved 2007-04-29

Дополнительно

ТРИС

Онкотическое давление (от др.-греч. ὄγκος — объем, масса) — коллоидно-осмотическое давление, это доля осмотического давления, создаваемая высокомолекулярными компонентами раствора. В плазме крови человека онкотическое давление составляет лишь около 0,5 % осмотического давления (3—4 кн/м², или 0,03—0,04 ат). Тем не менее, онкотическое давление играет важнейшую роль в образовании межклеточной жидкости, первичной мочи и др. Стенка капилляров свободно проницаема для воды и низкомолекулярных веществ, но не для белков. Скорость фильтрации жидкости через стенку капилляра определяется разницей между онкотическим давлением белков плазмы и гидростатическим давлением крови, создаваемым работой сердца. На артериальном конце капилляра солевой раствор вместе с питательными веществами переходит в межклеточное пространство. На венозном конце капилляра процесс идёт в противоположном направлении, поскольку венозное давление ниже онкотического давления. В результате в кровь переходят вещества, отдаваемые клетками. При заболеваниях, сопровождающихся уменьшением концентрации в крови белков (особенно альбуминов), онкотическое давление снижается, и это может явиться одной из причин накопления жидкости в межклеточном пространстве, в результате чего развиваются отёки.

Более простое объяснение, что такое онкотическое давление.