Глава 2. Эффекты заморозки и охлаждения

Если сейчас вам около сорока лет, то, когда еще через тридцать или сорок лет вы умрете, врачи или техники, оплаченные вашей страховой компанией, возьмут вашу кровь, через кровеносную систему пропитают ваши органы защитными веществами, и положат вас на покой — не на вечный покой, а на временный, и не в холодную землю, а в гораздо более холодную морозильную камеру. А несколько лет спустя рядом с вами, возможно, положат и вашу жену.

На первый взгляд, большинству людей подобная картина кажется неправдоподобной и даже немного отталкивающей. Она кажется им отталкивающей потому, что их сознание ассоциирует морозильные камеры с мертвыми тушами. Они находят ее неправдоподобной, поскольку знают, что кусок баранины выглядит довольно-таки мертвым и, кроме того, даже в морозильной камере при –2 °C° после нескольких лет мясо начинает портиться.

Также вспоминается тот факт, что иногда нам приходится ампутировать сильно отмороженный палец; мы не можем вернуть его к жизни, несмотря на то, что весь остальной организм нормально функционирует. Как же мы можем надеяться оживить человека, замороженного до мозга костей? Как мы можем быть уверенными, что это когда-либо будет возможно?

Несомненно, что простой универсальный оптимизм, недостаточно убедителен. Очень легко говорить, что наука будущего превзойдет воображение; но будет ли она в состоянии взять большой кусок замороженной солонины и восстановить из него живую корову, ту самую корову, которой когда-то был этот кусок? Нас интересует вероятное, а не едва возможное. Если бы наши шансы были такими же, как у этой гипотетической коровы, мы предпочли бы даже не беспокоиться об этом.

Чтобы обосновать нашу разумную уверенность, давайте тщательно изучим некоторые важные факты и оценки, касающиеся эффектов охлаждения и заморозки живых организмов.

 

Долгосрочное хранение
Наш главный аргумент базировался на одном факте и одном предположении. Справедливость того факта, что уже сегодня можно сохранять мертвых людей, по сути, без всяких повреждений, в течение неограниченного срока, может быть легко установлена.

Из химии хорошо известно, что при температурах, близких к абсолютному нулю (около –273 C°), скорости любых химических реакций становятся пренебрежительно малыми. Молекулы вещества практически неподвижны. Жизненные процессы в любом организме, охлажденном до такой температуры, становятся неизмеримо медленными, равно как и процессы разложения. Результаты экспериментов подтверждают этот теоретический принцип.

Доктор Харольд Т. Меримэн (Медицинский исследовательский институт ВМФ США, Национальный Медицинский Центр ВМФ США, Бетесда, Мериленд, США), ведущий авторитет в этой области, говорит: «При любых условиях, срок хранения при температуре жидкого азота, при –197 C°, может считаться практически бесконечным». (68)

Доктор Умберто Фернандес-Моран (Чикагский Университет), выдающийся эксперт в области биофизики, отмечает, что «… никакой метаболической активности при температуре жидкого азота не отмечалось…» Тем не менее, он отмечает, что химическая активность с участием короткоживующих молекулярных фрагментов, известных как «свободные радикалы», может происходить при –197 C°, и что долгосрочное хранение, возможно, должно осуществляться при температуре жидкого гелия (несколько градусов выше абсолютного нуля).

По расчетам, скорость реакции при температуре жидкого гелия ниже, чем при температуре жидкого азота примерно в 10 триллионов раз! (30)

Многие исследователи докладывали об аналогичных результатах. Общее мнение, основанное на длительных наблюдениях и существующих теориях, заключается в том, что тело, охлажденное до температуры жидкого азота может храниться без значительных изменений и ухудшений в течение как минимум лет, а, скорее всего, даже веков. Тело, охлажденное до температуры жидкого азота, может храниться, практически бесконечно.

Тогда очевидно, что проблема хранения — это не самая большая сложность. В каком состоянии тело находится, когда оно достигает температуры хранения, в таком оно и будет оставаться так долго, как это нужно. Если оно было живым, оно останется живым; если оно было до некоторой степени повреждено, оно так и будет до некоторой степени повреждено.

Главная опасность заключается в процессах заморозки и оттаивания. Давайте теперь узнаем, какой прогресс был реально достигнут в заморозке живых организмов и их оживлении.

 

Успехи в заморозке животных и тканей

Среди небольших и простейших организмов есть много видов, которые могут сами пережить глубокую заморозку до температур ниже точки замерзания, даже без какой бы то ни было специальной защиты, и некоторые виды, которым можно помочь это сделать.

Беккерель обнаружил, что некоторые микроскопические, примитивные животные, которые могут переносить обезвоживание, могут быть охлаждены после высушивания до температур, близких к абсолютному нулю, а после нагревания и увлажнения полностью восстанавливаются. (5) Поскольку вода выводится из организма до заморозки, нет никаких повреждений от формирования ледяных кристаллов.

Два японских ученых, Асахина и Аоки, работали с личинками насекомого Cnidocampa flavescens. Личинки были удалены из защитных коконов, охлаждены до –3 °C° на один день, а после этого помещены в жидкий кислород при –18 °C°. После нагревания, их сердца вновь начали биться, и некоторые из них дожили до следующего этапа развития «имаго»,[1] хотя ни один экземпляр не дожил до взрослого состояния. (2) Ученые предположили, что период предварительного охлаждения до –3 °C° на один день позволил ледяным кристаллам расти снаружи, а не внутри клеток; то есть, ледяные кристаллы формировались в межклеточном пространстве.

Большое количество защитных агентов было предложено для минимизации повреждений тканей животных при заморозке; возможно, самым успешным из них был глицерин. Первые свидетельства были представлены профессором Жаном Ростаном, работавшим со сперматозоидами лягушек; подвижность клеток сохранялась в течение нескольких дней при температуре от –4 C° до –6 C°. (94) (Точка замерзания чистой воды при обычном давлении 0 C°.) Позднее было установлено, что некоторые морозостойкие насекомые естественным образом содержат глицерин в своих телах! (110)

Другой успешно используемый защитный агент — это этиленгликоль, раствор которого был использован доктором Б. Дж. Люэтом и доктором М. К. Хартрингом при заморозке уксусных угриц (Anguillula aceti). Угрицы пережили погружение в жидкий воздух при температуре около –19 °C°, при условии, что и охлаждение и нагревание были достаточно быстрыми. (110) Предположительно, этиленгликоль вызывал обезвоживание и стимулировал аморфное, а не кристаллическое состояние воды в клетках.

Моллюски на северных побережьях, подверженные действию отрицательных температур во время отлива, по-видимому, замерзают и оттаивают по два раза в день в течение недель, однако выживают. Ученые полагают, что эти организмы тоже могут вырабатывать какой-то естественный защитный агент и продолжают исследования. (110)

Обратившись к более крупным и развитым формам жизни, мы обнаружим, что и тут ученые добились значительных успехов в заморозке и оживлении клеток, тканей и даже органов. Обычно требовалось использование защитных агентов, но в некоторых случаях удавалось обходиться без них.

Сперматозоиды быков после обработки глицерином хранились при температуре –79 C° (температура твердой углекислоты или «сухого льда») в течение 7 лет и при нагревании показали высокий уровень выживаемости. Но интересно отметить, что даже при такой температуре происходит небольшое ухудшение; более низкая температура улучшает результаты. (110) Также отмечалось, вопреки опыту с уксусными угрицами, что слишком быстрая заморозка может быть вредна. (110)

Человеческие сперматозоиды без использования защитных агентов переносят сверхнизкие температуры по-разному, в зависимости от донора и клеток. В одном исследовании до 10 процентов сперматозоидов пережило пятиминутное охлаждение; результаты варьировались от донора к донору, но для одного донора выживаемость клеток была одинаковой для температуры –79 C°, –196 C° и –269 C°. (110)

Драматическое свидетельство жизнеспособности замороженной человеческой спермы было представлено в статье New York Times (Detroit Free Press) от 6 сентября 1963 года. Два ребенка были рождены женщиной, оплодотворенной спермой, хранившейся в течение двух месяцев при температуре жидкого азота. По другим сообщениям, доктору Джерому К. Шерману из Арканзасского Университета удалось хранить сперму при этой температуре в течение трех с половиной лет без потерь жизнестойкости.[2]

Доктор С. У. Якоб с коллегами сообщили об охлаждении клеток коньюктивы[3] и спермы до менее чем 1 K° с сохранением жизнеспособности. (50)

Сердце куриного эмбриона после обработки раствором глицерина было охлаждено до –19 °C°, и биение сердца возобновилось после нагревания. Этот эксперимент побудил доктора Д. К. С. МакДональда из Университета Оттавы, эксперта в области низкотемпературной физики, написать: «… возможно, наступит день, когда вы, при желании, сможете „пребывать в спячке“ тысячу лет или около того в жидком воздухе, а потом быть „разбуженными“ снова, чтобы увидеть, как мир изменился за это время». (65)

В случае с млекопитающими, попытки заморозки, хранения, нагрева и оживления не были полностью успешными. Однако удалось добиться множества частичных успехов и многое узнать.

Наиболее известны эксперименты доктора Одри У. Смита из Национального Института Медицинских Исследований, Милл Хилл, Лондон, работавшего с золотистыми хомячками. Эти животные были успешно оживлены, будучи наполовину заморожены. В частности, более половины воды в мозгу превратилось в лед, и тела затвердели; тем не менее, эти млекопитающие пришли в себя и вернулись к нормальному функционированию. (110) Это очень важно, поскольку в некоторой степени показывает, что интеллектуальные способности могут переживать заморозку и оттаивание.

Следует отметить, что результаты доктора Смита были достигнуты грубыми средствами: заморозка осуществлялась с помощью холодных ванн и пузырей со льдом, и при оживлении использовались только искусственное дыхание и микроволновая диатермия. Ткани не были ничем защищены, хотя уже было известно, что эффект от защитных агентов может быть значительным.

Похожие результаты были достигнуты Андьюсом и Лавлоком, которые сообщили о выздоровлении и выживании в течение длительного времени от 80 до 100 процентов замороженных крыс. (110) Доктор Дж. Р. Кеньон и его коллеги охлаждали собак до температуры, близкой к точке замерзания, с прекращением сердцебиения и кровообращения и достигли достаточно полного восстановления, когда собаки выживали в течение многих недель после эксперимента. Для предотвращения накопления вредных продуктов метаболизма использовались химические вливания. (55)

Механизм повреждений при заморозке все еще недостаточно хорошо изучен. Различные типы клеток, и даже отдельные клетки одного типа, сильно отличаются по выносливости. Различные температурные интервалы также имеют свои особенные проблемы.

Эксперименты, направленные на проверку новых теорий и новых защитных агентов и методов, ведутся активно, но в сравнительно небольших масштабах. К тому времени, когда общество заинтересуется заморозкой, прогресс значительно ускорится. Не во всех случаях можно ускорить научный прогресс, просто увеличив расходы, но в этом отдельных случаях такая возможность существует. Очевидно, что по многим направлениям исследования не ведутся просто из-за недостатка специалистов.

Среди всего прочего, необходима работа по систематическому поиску новых защитных агентов.

Даже учитывая, что работа сейчас ведется с относительно небольшой скоростью, многие ученые настроены оптимистично. Доктор А. С. Паркес, член Королевского Общества, в предисловии к книге доктора Смита пишет, что в следующем десятилетии (1961-71) «Хранение [при глубокой заморозке] целых органов для трансплантации может стать возможным…»[4] (110)

Доктор Хуан Негрин мл. (Госпиталь Ленокс Хилл, Нью-Йорк) говорил в 1961 году: «Мы уже работаем над методами приостановки жизни с помощью заморозки всего тела. Мы уже добились успеха в работе с некоторыми животными». (117) Несомненно, некоторыми успехами мы будем обязаны методу проб и ошибок. Но для того, чтобы лучше понимать будущие перспективы и сегодняшние возможности, нам нужно изучить сегодняшние представления о повреждениях при заморозке.

 

Механизм повреждений при заморозке

Есть несколько причин, по которым клетки и ткани животных часто не выживают после глубокой заморозки, последующего хранения и нагревания.

Прежде, чем мы перечислим эти возможные причины повреждений при заморозке, следует отметить, что «не выживают» — это очень неопределенное и, возможно, вводящее в заблуждение выражение. Обычный критерий выживания — это возобновление функционирования в случае с органом или рост клеточной культуры или успешная трансплантация или автореплантация (пересадка ткани обратно в животное-донор) в случае с тканью. Ткань, находящаяся лишь немного ниже границы выживания называется «мертвой», а эксперимент, в котором лишь небольшая доля клеток выживает, обычно считается неудавшимся. Но на самом деле, почти удавшиеся и частично удавшиеся эксперименты дают значительные основания для оптимизма, поскольку они указывают на сравнительно небольшой объем повреждений.

Ниже перечислено несколько отдельных видов повреждений при заморозке, хотя не все из них являются взаимоисключающими.

1. Возможны механические повреждения при формировании кристаллов льда.

Наиболее очевидная возможность повреждений связана с колющим, давящим или разрывающим действием формирующихся ледяных кристаллов на клеточные мембраны и целые клетки. Странно, однако, что подобные результаты наблюдаются довольно редко, хотя иногда это и может происходить. (В случае с растительными клетками, с их более жесткими мембранами, подобные повреждения происходят намного легче.)

При медленном охлаждении со скоростью около одного градуса в минуту чистый лед постепенно отделяется от клеточного раствора, и кристаллы льда формируются за мембраной в межклеточном пространстве. Более медленное охлаждение увеличивает размер формирующихся кристаллов и уменьшает их число; более быстрое охлаждение — наоборот. По достижении так называемой эвтектической температуры[5] остаток раствора замерзает и превращается в смесь кристаллов льда и различных солей и гидроксидов.

Существует достаточно доказательств того, что формирование кристаллов льда не всегда смертельно, несмотря на то, что вода при замерзании расширяется. Меримен пишет: «Экспериментальные работы в области обморожений показали, что нога собаки может выдержать охлаждение тканей до температур существенно ниже точки замерзания на время до тридцати минут… Нет никакого сомнения, что ледяные кристаллы формируются, но, несмотря на это, ткань выживает… довольно уверенно можно утверждать, что в мягких тканях, свойственных представителям Царства животных, возможно формирование ледяных кристаллов в межклеточном пространстве и значительное сжатие ими клеток без негативного воздействия на выживаемость последних». (70)

При быстрой заморозке формируются кристаллы льда значительно меньшего размера, и, возможно, именно поэтому, опасность механических повреждений намного меньше, хотя общий объем льда, естественно, не меняется. С другой стороны, при быстрой заморозке вода не успевает покинуть клетку, из-за чего формируются небольшие внутриклеточные или даже внутриядерные кристаллы льда, что создает опасность повреждений. Размер этой опасность сложно оценить, но она может быть значительной — кристаллы льда могут, к примеру, повредить ядро клетки.

2. Возможна опасная концентрация электролитов.

Поскольку заморозка вызывает разделение воды (в виде льда) и растворенных в воде веществ, происходит дегидратация. Жидкость, остающаяся в клетке имеет необычайно высокую концентрацию солей и других веществ с близким строением, называемых «электролитами», которые обладают особыми электрическими и химическими свойствами. Подобные значительные изменения внутри клетки могут быть для нее губительными. (69)

Повреждения клетки зависят от концентрации электролитов, времени воздействия и температуры; меньшая температура означает меньшую скорость реакции. В зависимости от типа клетки и других факторов, концентрация электролитов становится опасно высокой при температурах от 0 C° до –25 C°. Следовательно, при отсутствии защитных вливаний охлаждение в этом интервале температур должно быть максимально быстрым.

Доктор Джей. Э. Лавлок полагает, что особой опасности денатурирования и изменения химических свойств подвержены липопротеины. «Частым, если не постоянно встречающимся, компонентом многих мембран в сложной живой клетке являются липо-протеидные комплексы… связанные не сравнительно сильными ковалентными связями, соединяющими атомы в простом белке, но слабыми ассоциативными силами, схожими с теми, что поддерживают мыльный пузырь… Эти комплексы часто нестабильны и, вероятно, постоянно обновляются с помощью внутриклеточного синтеза… Заморозка [легко может] денатурировать более чувствительные липопротеиновые комплексы живой клетки.

Высокая чувствительность липопротеиновых комплексов к неблагоприятным эффектам заморозки заставляет предположить, что не только главная клеточная мембрана, но и меньшие мембраны… могут получить необратимые повреждения во время заморозки. Глубокие изменения в окружении клетки, происходящие во время заморозки, также могут причинять вред более стабильным молекулярным компонентам клетки». (62)

Чтобы не нагнетать лишнего страху, стоит отменить, что далее он продолжает: «… многие живые клетки и ткани успешно хранились в замороженном состоянии… несмотря на эту огромную опасность».

Нельзя забывать также, что фраза «необратимые повреждения» используется слишком бесцеремонно и на самом деле означает лишь «повреждения, которые невозможно обратить с использованием доступных на сегодня методов».

3. Возможна неустойчивость обмена веществ.

Доктор Л. Р. Рей, выдающийся исследователь из парижской École Normale Supérieure, уверен, что клетки могут приходить в беспорядок из-за неравномерного воздействия холода на сбалансированные жизненные процессы. «Действие различных ферментов прекращается при различной температуре… это может приводить к ненормальному накоплению промежуточных продуктов обмена веществ, которые обычно существуют недолго и которые могут оказаться токсичными или направить обмен веществ в другом направлении». (90)

Это звучит довольно многообещающе, поскольку это дает надежду на то, что, изучив эти процессы и разработав средства для их корректировки, мы научимся восстанавливать нарушенный баланс обмена веществ.

Сходным образом прокомментировал ситуацию доктор Л. Крейхерг. «Является очевидным, что в областях организованной ткани in situ  [на своем месте] пределы выживания клеток после заморозки… определяются не толерантностью отдельных клеток, но локальной реакцией на беспорядок в „социальной жизни“ клеток». (56) Можно предполагать, что схожий комментарий может относиться и к условиям внутри отдельной клетки и взаимодействию ее частей.

4. Возможен термальный шок и осмотический шок.

Быстрая заморозка оказывается смертельной для многих клеток по малоизученным пока причинам. Одна из гипотез, говорящая о «термальном шоке», предполагает, что различные вещества в клетках и мембранах при понижении температуры сжимаются с различной скоростью, что приводит к разрушительному механическому напряжению. «Осмотический шок» относится к неблагоприятным эффектам внезапных изменений в концентрации растворов, разделенных мембранами.

5. Возможны повреждения во время хранения.

Во время охлаждения клетка в каждом температурном диапазоне сталкивается, в зависимости от многих факторов, с различными превратностями и даже когда она, наконец, достигает температуры хранения, ее беспокойства еще не окончились. Как уже отмечалось, существуют свидетельства тому, что при всех температурах, кроме самых низких, близких к абсолютному нулю, со временем, хотя и очень медленно, происходят ощутимые изменения.

Хотя Фернандес-Моран отмечал, что активность свободных радикалов может продолжаться и при –196 C°, и предположил, что долгосрочное хранение, скорее всего, должно происходить при температуре жидкого гелия, тем не менее, большинство авторов согласны, что и хранение при температуре кипения азота, вероятно, вполне безопасно.

В любом случае, слово «разложение» плохо описывает порчу, которая происходит при низких температурах. Вполне вероятно, что в этом случае происходят не обычные процессы гниения и разложения или даже обычного, хотя и с пониженной скоростью, обмена веществ, а, скорее, несколько чувствительных процессов, идущих к своему завершению, после чего в течение неограниченно долгого времени состояние организма остается неизменным. Если это так, то охлаждение с помощью сухого льда на длительный период может быть таким же надежным, как и охлаждение жидким гелием, за исключением небольших первоначальных повреждений. По этому поводу, впрочем, я не могу сослаться на авторитетный источник, и многие вопросы пока остаются без ответа.

6. Возможны повреждения при нагревании.

Существует множество свидетельств того, что при нагревании наносятся большие повреждения, чем при заморозке, особенно, если нагревание производится медленно и при отсутствии защитных примесей. Механизм таких повреждений, вероятно, включает блуждающую рекристаллизацию льда (небольшие кристаллы могут соединяться в более крупные кристаллы, вызывая механические разрывы) и формирование пузырьков газа, а также другие процессы. Подобные эффекты могут происходить при температуре –4 °C° и выше.

В течение некоторого времени предполагалось, что сложности, связанные с обеспечением быстрого нагревания, чрезвычайно серьезны для всех живых организмов, кроме самых мелких, для которых теплообмен не является проблемой. Однако сейчас стало ясно, что микроволновая диатермия и индуктивные методы позволяют добиться быстрого более или менее равномерного нагревания всего тела даже для крупных организмов. Эти методы включают использование высокочастотных радиоволн, переменных электромагнитных полей; первые аналогичны обыкновенной лампе-нагревателю, вторые — так называемым электронным духовкам. Устройства для нагревания были описаны Лавлоком. (61) С использованием подобных методов кролики могут быть нагреты в течение нескольких секунд. (110)

7. Возможны прочие вредоносные эффекты.

Различные свидетельства и предположения указывают на дополнительные возможности повреждений при заморозке. Лекарства и антибиотики, как и вещества, присутствующие в организме естественным образом, могут достигать смертельных концентраций. При температуре сухого льда при использовании глицерина возможно неполное замерзание, и слабая растворимость солей в глицерине может привести к медленным повреждениям. При чрезвычайно низких температурах полное замерзание воды может коснуться и молекул, необходимых для цельности белков. И так далее; многое уже известно, но куда больше только предстоит узнать.

Подводя итог, скажем: если нас интересует главная опасность для людей, замороженных без насыщения защитными веществами, согласованное мнение экспертов указывает на денатурацию белков, связанную с действием концентрированных солевых растворов, что, в свою очередь, является результатом слишком медленного охлаждения. Что касается возможности избежать этой опасности с помощью защитных агентов или увеличения скорости заморозки, то более подробно об этом будет рассказано позже.

 

[1] Имаго  — последняя стадия развития насекомого

[2] Сейчас в мире существует множество банков спермы, включая такие необычные как банки спермы нобелевских лауреатов, выпускников Гарварда, звезд Голливуда или военнослужащих. отправляющихся в горячие точки. На сегодняшний день в мире из замороженной спермы родилось более 50 тысяч человек.

[3] Коньюктива  — слизистая оболочка глаза.

 

[4] Первая успешная пересадка замороженных органов была произведена в начале 2002 года. Группе канадских ученых под руководством Роджера Госдена удалось пересадить крысам замороженные яичники.

 

[5] Эвтектическая температура  — температура, при которой жидкая фаза находится в равновесии с несколькими твердыми фазами.