Отчет Института Крионики по научным исследованиям за 2003 год
Автор:Юрий Пичугин, доктор наук, штатный криобиолог, Институт Крионики
В течение второго года моих исследований в Институте Крионики (ИК) я провел 67 экспериментов на срезах гиппокампа крыс с выполнением 200 задач, 9 экспериментов с живыми сердцами крыс, 18 опытов с перфузией целых голов крыс, и 8 экспериментов с перфузией голов овец.
Цель всех экспериментов было создание витрификационного метода для Института Крионики. Я не могу сообщить о конкретных результатах экспериментов, потому что институт, возможно, оформит патент с этими результатами.
Были испытаны комбинации всех лучших криопротекторов в качестве смеси для витрификации, используя живые срезы мозга крысы и функциональный тест отношение K/Na. Несколько витрификационных смесей может криоконсервировать срезы мозга с 75% выживаемости. Наилучшие витрификационные смеси могут сохранить живые срезы мозга с 85% выживаемости после витрификации до -135ºС. Метод ИК с глицерином дал только 20% выживания срезов мозга при лучших условиях замораживания. 85% и 20% является существенной разницей.
Я старался и для живых крысиных сердец тестировать наилучшую витрификационную смесь. Сердце может восстановиться согласно принципу: всё или ничего. Это будет либо ровное биение сердца, либо только какая-то фибрилляция, которая прекратится во время инкубации сердца. К сожалению, те крысиные сердца были не способны восстановиться после использования лучшей витрификационной смеси даже без глубокой заморозки. Все известные криопротекторные агенты токсичны для живых органов при высоких витрифицирующих концентрациях (55-70%), либо они не могут защитить органы от повреждения при замораживании при более низких концентрациях. Криобиология пока ещё не может создать метод криоконсервирования, который может сохранить органы, такие как сердце, почки, печень и другие, с полным восстановлением для трансплантации.
На сегодняшний день от крионики по сравнению с современной криобиологией не стоит ожидать совершенно идеального метода криоконсервации, потому что юридически умершие пациенты уже имеют дефекты человеческой природы, которые являются результатом их смерти и все эти последствия должны быть излечимы будущими медицинскими технологиями. 85% выживаемости ткани мозга – это хороший результат по сравнению с предыдущим методом криоконсервации Института Крионики и поэтому мы должны тщательно разработать лучший метод для всего мозга и тела пациентов. Итак, метод витрификации следует проверить не только на срезах мозга, но и на целом живом мозге животного.
Когда я начинал работать с целыми головами крыс, у меня была трудность с гематоэнцефалическим барьером. Барьер для крысиного мозга был менее проницаем для криопротекторов, чем для мозгов людей и других млекопитающих, таких как овцы, кролики, кошки, собаки и т.д. Мои недавние эксперименты с криопротекторной перфузией голов только что умерших овец показывают, что гематоэнцефалический барьер овцы даже для глицерина более проницаем, чем для крысы. Тем не менее, высокая степень обезвоживания мозга наблюдалась вместе с лучшим проникновением криопротектора.
К сожалению, Институту Крионики не разрешили работать без лицензии с живыми животными, кроме крыс. Для Института получить лицензию было очень дорого. Головы мертвых овец не подойдут для этой цели. Мне нужно использовать живых кроликов для того, чтобы применить анализ чувствительного функционального K/Na теста для живых срезов гиппокампа. Я могу перфузировать головы кроликов криопротекторами, охладить их до -130◦, подержать при этой температуре, отогревать, промывать от криопротекторов и приготовлять срезы гиппокампа из промытых мозгов кролика, чтобы установить их выживаемость по анализу K/Na соотношения. Я буду искать возможность снять небольшое помещение в местном университете, в котором есть лицензия на законную работу с живыми кроликами.
Моя работа со срезами живого мозга крысы оказалась очень полезной, а результаты работы не потеряли своей значительности для будущих экспериментов с криопротекторной перфузией целых голов, потому что клетки мозга млекопитающих, в сущности, не отличаются от млекопитающего к млекопитающему. Если создать экспериментальные условия витрификации для клеток мозга кролика такими же, как для срезов мозга крысы, выживаемость клеток для этих случаев должна быть одинаковой в пределах экспериментальных ошибок. Учеными подтверждено, что выживаемость клетки ин витро (для срезов мозга) и выживаемость ин виво (для всего мозга) были похожими, например, в отношении токсичных веществ или лекарственных препаратов, если гематоэнцефалический барьер был достаточно хорошо проницаем для этих веществ. Мои эксперименты с дегидратацией срезов мозга крыс диффузией и с дегидратацией ткани всего мозга крысы глицерином или перфузией крысиных голов сахарозой показали почти такое же выживание клеток согласно K/Na теста.
Для моих будущих исследований у меня есть два варианта планов. Первый вариант - это идеальный план для получения наилучших результатов.
- Определить степень дегидратации и проницаемости глицерина для гематоэнцефалического барьера после смерти человека при 0ºС в стандартных условиях. Человеческие трупы должны быть относительно свежими, то есть их нужно хранить при 0ºС не дольше 12-14 часов.
- Определить, какой вид животных наиболее близок человеку в отношении проницаемости глицерина через гематоэнцефалический барьер мозга. Нужно использовать кроликов, кошек и маленьких собачек. Будут выбраны подходящие модели животных для последующих исследований.
- Выбрать лучшую витрификационную смесь из хороших витрификационных смесей, используя подходящую модель животного и K/Na тест и электрофизиологию.
- Проверка лучшей витрификационной смеси на достаточно свежих человеческих трупах и попытка витрифицировать головы при -130 ºС.
- Изучение возможностей охлаждения головы человека до -196 ºС без трещин.
Осуществлять план в США было бы слишком трудным и дорогим для ИК. Полагаю, он мог бы осуществлен в России в сотрудничестве с российскими крионистами и учеными.
Во второй мой план входит работа с живыми кроликами в районе Мичигана, если я смогу получить лабораторию с лицензией в университете.
- Найти оптимальный метод введения наилучших витрификационных смесей в головы кроликов таким образом, чтобы избежать чрезмерной дегидратации мозга, потому что это один из серьезных повреждающих факторов. Для этого нужно определить оптимальные технические параметры криопротекторной перфузии: скорость введения криопротектора, температура и скорость её снижения, а также скорость увеличения концентрации криопротектора в витрификационных смесях.
- Убедиться в полной витрификации головы кролика, оптимально насыщенный с наилучшей витрификационной смесью при охлаждении до -130 ºС.
- Найти оптимальный способ отмывания голов кроликов от криопротекторов и оценки результатов с использованием процедуры приготовления срезов мозга из промытых мозгов.
- На основании результатов, рассчитать технические параметры витрификационного метода для овечьих и человеческих голов.
- Проверить параметры для голов овец на практике, используя метод витрификации.
