Вы здесь

Японские биологи разработали новый метод, с помощью которого можно сохранять нервную ткань в рабочем состоянии.

Ученые из Центра исследований динамики биологических систем Riken в Японии при помощи новой методики смогли поддерживать эксплантированные ткани мозга мыши живыми и функционирующими на протяжении почти месяца. Результаты опубликованы 09.10.2019 в журнале Analytical Sciences.

* Эксплантация – Метод сохранения жизнеспособности тканей, или целых органов (культура органа), или отдельных клеток (культура клеток) вне организма in vitro с созданием условий, обеспечивающих питание, газообмен и удаление продуктов метаболизма.

Их работа посвящена культивированию эксплантированной ткани – то есть тому, как не дать разрушиться участку органа после извлечения его из тела животного. Однако эксплантированные ткани могут сохранять свои функции только от нескольких часов до нескольких дней в микрофлюидных устройствах, хотя их наблюдения необходимы в течение нескольких недель.

С отдельными клетками этой проблемы не возникает, большинство из них спокойно чувствуют себя в лабораториях. Но когда речь заходит о сложной структуре, такой как нервная система, важно не только, чтобы клетки оставались в живых, но и чтобы они не теряли своих функций и продолжали слаженно работать. С одной стороны, ткани быстро высохнут и погибнут, если не будут храниться в богатой питательными веществами влажной среде, с другой – чрезмерное помещение ткани в жидкость, утопление в ней, может привести к повреждению, нарушив газообмен.

В качестве объекта исследований японские биологи выбрали супрахиазматическое ядро, – крошечный участок мозга, отвечающий за биологические ритмы.

* Супрахиазматическое ядро (супрахиазмальное ядро, СХЯ; (лат. nucleus suprachiasmaticus) – надперекрёстное – ядро передней области гипоталамуса. Супрахиазматическое ядро – главный генератор циркадных ритмов у млекопитающих, управляет выделением мелатонина в эпифизе и синхронизирует работу «биологических часов» организма. Активность нейронов СХЯ изменяется периодически в течение суток и подстраивается под внешние световые сигналы.

Это замкнутая структура из десятков тысяч нейронов, каждый из которых обладает своим суточным ритмом, но на выходе эта нейронная сеть генерирует, посредством синхронизации отдельных клеток в этой области, один мощный сигнал – «время на биологических часах» организма.

Синхронизированные и сложные межклеточные взаимодействия СХЯ-клеток культивировать in vitro, то есть  воспроизвести из посевных клеток, довольно сложно: при недостатке воды ткань быстро высыхает, но если покрыть ее раствором и промывать, как это делают с обычными культурами, то ток жидкости разрушает связи между нейронами.

Поэтому авторы работы сконструировали микрофлюидную платформу, позволяющую поддерживать давление жидкости постоянным и не травмировать ткань.

Микрофлюидные устройства являются важными платформами для культивирования и наблюдения за биологическими тканями. По сравнению с обычными установками, микрофлюидные устройства имеют преимущества в перфузии, в том числе повышенную возможность доставки питательных веществ и газов к тканям. Ученые использовали специальное микрофлюидное устройство, которое помогло увлажнить и предотвратить высыхание тканей, эксплантированных из мозга мыши, но при этом поддерживать увлажнение на оптимальном уровне. Суть в том, что устройство содержало полупроницаемый канал, покрытый искусственной мембраной, и стенки, изготовленные из полидиметилсилоксана (PDMS) – химического вещества, часто используемого в качестве антипенного агента в безрецептурных препаратах. Это означает, что ткани не нужно оставаться постоянно погруженной в жидкость: она могла получать питательные вещества из влажной среды, поскольку та циркулировала в полупроницаемом канале и проходила через искусственную мембрану, не нарушая газообмен.

 «В данной работе предложена новая перфузионная платформа, сочетающая микрожидкостное устройство PDMS с пористой мембраной для культивирования эксплантированной СКН в течение 25 дней. Мы ожидаем, что эта платформа обеспечит универсальный интерфейс для микрофлюидных манипуляций с тканевыми эксплантатами», – говорится в аннотации к работе.

Рис 2. Образование капель на мембране вставки культуры ткани: (а) иллюстрация образования капель, (б) экспериментальная установка и наблюдаемое образование капель, (i) Образование капель, когда скорость извлечения из среды была меньше скорости инфузии. Объем капли увеличивался, и в конечном итоге капля разрушалась, (ii) Образование капли не происходило, когда скорость извлечения была равна или немного больше скорости инфузии, (iii) Образование небольшой капли, когда скорость извлечения была больше скорости инфузии. Небольшой объем жидкости накапливался и многократно отводился в выпускной канал.

«Контролировать поток среды было сложно, потому что микроканал, который образовался между стенками PDMS и пористой мембраной, был необычным, – объяснил ведущий автор работы Нобутоши Ота (Nobutoshi Ota). – Тем не менее, мы добились успеха после проб и модификаций пористой мембраны и регулировки скоростей потока на входе/выходе».

Когда поток был налажен, исследователи проверили устройство на тканях из мертвого мышиного мозга, ответственных за регулирование циркадного ритма – супрахиазматического ядра.

Для того чтобы подтвердить, что СХЯ осталось целым и функциональным, ученые использовали трансгенных животных. У мышей-доноров ткани одновременно с геном PER2,  одним из ключевых генов биоритмов, запускался ген люциферазы.

* Люцифера́за  – общий термин для класса окислительных ферментов, катализирующих реакцию, сопровождающуюся испусканием света, биолюминесценцией. Наиболее широко известна люцифераза светлячков. Название фермента, также как и его субстрата люциферина, происходит от слова Люцифер («светоносец»). 

Поэтому на пике экспрессии PER2 клетки ядра синхронно светились. Исследователи измеряли и сравнивали свечение в СХЯ, которое культивировали обычным способом, время от времени обновляя среду, со свечением в образцах, помещенных в микрофлюидное устройство.

Оказалось, что цикличность свечения и, следовательно, функциональная активность нейронов затухает гораздо медленнее при новом, микрофлюидном способе культивирования. В статичных культурах колебания сходили на нет к пятому дню, а в микрофлюидных их можно было наблюдать и на 25-й день.

Рис. 3. Циклические колебания культивируемых срезов СХЯ, (a) Временной ход биолюминесценции, записанный на срезах СХЯ, полученных микрофлюидными перфузионными культурами (верхний ряд, n = 3) на 8 дней. (B) Усредненное снижение яркости ткани: микрофлюидные перфузионные культуры (красный, n = 3) и обычные статические культуры (синий, // = 12). Светлые области обозначены стандартными отклонениями. Пунктирная вертикальная линия указывает на 10-часовую инкубацию, при которой объем перфузированной среды и объем среды в статической культуре эквивалентны, (c) обычные статические культуры (синие). Столбики ошибок указывают стандартные отклонения. Красные точки представляют собой индивидуальные значения, (d) Микроскопические изображения среза SCN, культивированного на перфузионной платформе, записанные каждые два часа в течение 25 дней.

Исследователи полагают, что время жизни такой культуры супрахиазматического ядра может быть гораздо дольше – до сотни дней.

Таким образом, японские биологи разработали новый метод, с помощью которого можно сохранить нервную ткань в рабочем состоянии. Он, безусловно, может пригодиться на практике – например, чтобы изучать структуру нервной ткани, взаимное расположение клеток и их функции, что не всегда удается сделать в мертвом мозге. «Этот метод можно использовать не только для эксплантации тканей животных, – рассказал Ота. – Кроме того, это улучшит исследования в области органогенеза».

Теперь команда ученых из Riken нацелена на долгосрочные эксперименты, в которых они собираются пронаблюдать за образованием кровеносных сосудов и движением клеток во время развития органоидов.

Поделиться