Вы здесь

Формирование вкусового условного рефлекса (аналога долговременной памяти) у нематод

Японские нейробиологи изучили формирование вкусового условного рефлекса (аналог долговременной памяти) у нематоды C. elegans. Удалось расшифровать стержневой биохимический механизм этого рефлекса, проследив его путь от сформировавшегося поведенческого стереотипа к регуляторным белкам. 

Биохимическая часть рефлекторного ответа включает общие с млекопитающими (и человеком) элементы — особые сигнальные белки инсулинового рецептора. Ученые полагают, что это делает их исследование перспективной моделью для изучения человеческой памяти и ее соответствующих дефектов.

Caenorhabditis elegans — свободноживущая нематода (круглый червь) длиной около 1 мм. Исследования этого вида в молекулярной биологии и биологии развития начались в 1974 работами Сиднея Бреннера. Широко используется как модельный организм в исследованиях по генетике, нейрофизиологии, биологии развития, вычислительной биологии. Геном полностью секвенирован и опубликован в 1998 году (дополнен в 2002).

В рамках проекта NemaLoad проводится изучение коннектома нематоды C. elegans. Этот проект позволит создать единую картину всех функциональных элементов ее нейронной регуляции. На сегодняшний момент достигнута картина лишь отдельных блоков функционирования ее нервной системы.

Коннекто́м - (англ. connectome /kəˈnɛktoʊm/) — полное описание структуры связей в нервной системе организма. Область исследований, включающая в себя картографирование и анализ архитектуры нейрональных связей, называется коннектомика.

Коннектомами ученые занялись еще в 60-х годах прошлого века. Тогда будущий Нобелевский лауреат Сидней Бреннер (Sidney Brenner), южно-африканский биолог, предположил, что поведение живого организма можно понять, составив полную карту его нервной системы. Он взялся за простейшую нервную систему круглого червя Caenorhabditis elegans (всего 302 нейрона, распределенных по всему телу), и, изучая один за другим его тонкие срезы, создал за два десятилетия полную нейронную, карту, нанеся на нее все нейроны и 7 000 соединений между ними. В 1986 году она была опубликована в Philosophical Transactions of the Royal Society of London, почтенном научном журнале, основанном еще Исааком Ньютоном. Номер вышел объемным, в 340 страниц, и с тех пор многие биологи называют его Книгой, причем не столько из-за фолиантной толщины, сколько из-за информации, которая там содержится, и сегодня, спустя почти три десятилетия, остается для исследователей сборником вопросов без ответа.

Потом на основании этой схемы сделали виртуальную нематоду — запрограммировали для нее виртуальную среду и попытались заставить модель червячка ползать по модели среды. Но толку от такой модели оказалось немного: простенькое поведение нематоды воспроизвести не получилось, потому что мы не знаем многих подробностей работы ее нервной системы. Нужно создавать не просто коннектом, а функциональный коннектом — живую карту активности нервной системы в реальном времени. 

Реконструкция коннектома нематоды. Шарики – это тела нейронов, линии – аксоны и дендриты (отростки, по которым передается нервный импульс).

Почти тридцать лет назад на лекциях на биологических факультетах рассказывали, что у червяков, как и у высших животных, можно выработать условный рефлекс. Тогда этот факт слушателями воспринимался почти как чудо, а верхом творческой мысли виделся Т-образный лабиринт, в котором червяки испытывались на наличие рефлекса. За эти тридцать лет нейробиология (да и вся биология) постепенно, но очень быстро и кардинально обновилась: Эрик Кандель получил за исследование условных рефлексов моллюска аплизии Нобелевскую премию (в 2000 году), ученым удалось залезть в святая святых нейронных передач — синапсы и их хозяйство, и т. д. Теперь изучение условных рефлексов и, соответственно, обучения и памяти у низших беспозвоночных стало нейробиологической рутиной; придумано множество изящных способов формировать и исследовать их условные рефлексы (см., например, Саранча учится на горьком опытеМухи хранят информацию на «съемных дисках», ; Насекомые ощущают удовольствие с помощью дофамина, как и млекопитающие, 08.11.2012). Мало того, стал подвластен расшифровке механизм образования рефлексов как на уровне нейронных связей, так и на уровне молекулярных каскадов и генов, их кодирующих. Расстояние, пройденное от Т-образного лабиринта до выключаемого ультрафиолетом отдельного белка в конкретном нейроне у изготовленных мутантов, огромно.

Всеми этими новейшими технологиями воспользовались нейробиологи из Токийского университета и программы CREST Японского агентства науки и технологии. Они представили схему работы условного рефлекса: как он срабатывает на клеточном, нейронном, и молекулярном уровне. В их результатах проступают биохимические мотивы формирования долговременной памяти.

Они работали с хорошо известной нематодой C. elegans. У нематод вырабатывали условный рефлекс на присутствие соли. Этот условный рефлекс выступил в качестве одного эпизода памяти. Известно, что нематоды реагируют на определенную концентрацию соли и могут ее запомнить. Известно, что вкусовую рецепцию у нематод обеспечивает нейрон ASER (или его левый аналог ASEL). Также известно, что в процесс запоминания каким-то образом вовлечены белки сигнального каскада инсулинового рецептора PI3K, который участвует в том числе и в процессе запоминания и обучения у высших животных. С этой информации и началось исследование.

Нейрон ASEL, высвеченный зеленым белком Левая стрелка —  аксон, правая — тело нейрона.

Аксон (др.-греч. ἄξων «ось») — это нейрит (длинный цилиндрический отросток нервной клетки), по которому нервные импульсы идут от тела клетки (сомы) к иннервируемым органам и другим нервным клеткам

Си́напс (греч. σύναψις, от συνάπτειν — соединение, связь) — место контакта между двумя нейронами или между нейроном и получающей сигнал эффекторной клеткой. Служит для передачи нервного импульса между двумя клетками, причём в ходе синаптической передачи амплитуда и частота сигнала могут регулироваться. 

Нематод выращивали в среде с определенным количеством соли, но одну группу при этом кормили как следует, а другую держали на голодном пайке. Поэтому у сытой группы та или иная концентрация соли стала ассоциироваться с пищей, а у голодной группы — с голодом. В последующих испытательных тестах нематод сажали в лотки с неоднородной концентрацией соли: она постепенно менялась от одного края лотка к другому от низкой (близкой к нулевой) к высокой. Ученым оставалось только отмечать, в какую сторону отправятся нематоды — к краю с низкой или с высокой концентрацией соли.

Понятно, что все нематоды, согласно выработанному рефлексу, устремлялись к той концентрации соли, которая ассоциировалась у них с пищей. Сытая группа ползла туда, где ощущалась концентрация, знакомая им по благополучной жизни, голодная группа, напротив, именно ее избегала.

Как оказалось, этот рефлекс отсутствует у особей, мутантных по гену daf-2 — это один из участников каскада PI3K. Выяснилось, что в синапсах нейрона ASER, и только там, экспрессируется его особая изоформа. Ее назвали daf-2c: она произведена из другой изоформы daf-2a путем вставки дополнительного экзона.

Экзоны [от анг. ex(pressi)on — выражение] — участки ДНК, копии которых составляют зрелую РНК.

Точно такая же вставка известна и для человеческого инсулинового рецептора IR-B. И у нематод, и у человека эта экзонная вставка экспонируется на поверхности нейронов в синапсах.

Строение аналогичных инсулиновых рецепторов и их изоформ со вставками (показана красным цветом) у нематоды (слева) и человека; и в том и в другом случае вставки экспонируются на поверхности клеток.

Эта аналогия сама по себе захватывающая и сулит немало перспективных открытий в области молекулярных механизмов и эволюции обучения. С человеческими вариантами этих изоформ работы продолжаются, но с результатами данного исследования нематоды их явно обогнали. Удалось выяснить детали процесса запоминания и то, как работают биохимические механизмы в это время.

Эксперименты с мутантами по daf-2c, а также другими участниками сигнального каскада инсулина, показали, что именно эта изоформа, а не daf-2a, участвует во вкусовом обучении. Она экспрессируется только в аксонах ASER, а вторая изоформа — в теле клетки. Для выработки рефлекса важно, чтобы DAF-2c оказался в аксоне рядом с синапсом. Поэтому первоочередную роль получают белки, переправляющие их из тела клетки в аксон. Одним из таких агентов оказался трансмембранный белок CASY-1 из суперсемейства кадгеринов. CASY-1 специфически связывается с новой экзонной вставкой DAF-2c. У мутантов по этому белку (варианту гена) DAF-2c до аксона не добирается, и в результате никакого обучения не происходит. Интересно, что если мутанту вместо DAF-2c насильно (с помощью связующих белков) вставить в аксон DAF-2а, то он сработает так же, как и DAF-2c. Иными словами, для данного вида рецептора важно место; специфическая вставка понадобилась, чтобы это место правильно занять.

У нематод в норме реакция на соль выражается в увеличении количества пузырьков в синапсе нейрона ASER. Применив изощренную технологию, ученые измерили количество пузырьков в синапсах при нормальном проявлении рефлекса, а затем сравнили с мутантными нематодами. У мутантов по daf-2 концентрация пузырьков оказалась сильно повышенной. Зато если включить мутантам daf-2c, то всё возвращается к норме. А включение daf-2а ничего не изменяет: концентрация синаптических везикул остается высокой. Также меняется концентрация везикул и у мутантов по гену casy-1 — она резко возрастает. Это означает, что присутствие DAF-2c увеличивает интенсивность нервной передачи.

Вези́кула (в цитологии) —относительно маленькие внутриклеточные органоиды, мембрано-защищённые сумки.

Результаты тестирования нематод, выращенных в голодных солевых условиях (им снизили концентрацию соли в два раза и измерили количество пузырьков в синапсе). По сравнению с нормой (WT, wild type) у мутантов (casy-1, daf-2) резко повышена концентрация пузырьков; если добавлять daf-2c (Ex[daf-2c], Ex — expression), этот эффект сглаживается (чего не происходит, если добавлять daf-2a). То же самое получается, если насильно вставить daf-2а на место daf-2c (конструкция daf-2a::CICD). Рисунок из обсуждаемой статьи
CASY-1, в свою очередь, связывается с кинезинами микротрубочек, а они обеспечивают перемещение везикул в синапсы.
Получается, что в аксоне ASER, обслуживающем вкус, и только там, экспрессируется особая форма инсулинового рецептора; она связывается с трансмембранным белком CASY-1, который умеет взаимодействовать с кинезином, и таким образом модулируются нервные импульсы. В этой истории осталось понять, при чем тут условный рефлекс и обучение, то есть как регулируется извне продукция ключевого компонента daf-2c.

Кинезины — суперсемейство моторных белков эукариотических клеток. Кинезиныдвигаются по микротрубочкам, используя энергию гидролиза АТФ. 
Удалось обнаружить вещество, которое по мере «воспитания» нематод в голодных условиях снижает свою активность — это важнейший клеточный регулятор ERK. Это вещество соответственно тормозит активность CASY-1 (это тоже пришлось долго и педантично доказывать с помощью использования разнообразных мутантных вариантов). В этом случае DAF-2c доставляется в аксоны в умеренном количестве, везикулы в синаптические щели не выбрасываются, и в результате реализуется рефлекс — избегание солевой концентрации.

Схема реализации рефлекса от внешнего стимула до поведенческой реакции через молекулярные регуляторные каскады.
С одной стороны, всё проделанное японскими учеными — просто, а с другой — сложно. Просто — потому что мы видим расшифрованную схему формирования рефлекса. Сложно — потому что тут пришлось задействовать не меньше десятка различных технологий тестирования, для каждой — понять, что означает результат теста, перебрать больше сотни вариантов мутаций нематод и у каждого вырабатывать рефлекс. Помимо этого сложность обусловлена еще и сильным упрощением. Ясно, что на нее накладываются и другие регуляторные механизмы. Например, с тем же самым вкусовым рефлексом работали и раньше и обнаружили специальный белок нематоцин, аналог окситоцина, который также участвует в формировании данного рефлекса (см. Половое поведение и обучение у C. elegans регулируется пептидом, похожим на окситоцин, «Элементы», 31.10.2012). В этой новой работе нематоцин не упоминается, хотя было бы интересно и важно понять, где пересекаются метаболические регуляторные пути нематоцина и DAF-2c.

18.08.2014 Елена Наймарк

 

 

Поделиться