Влияние искусственного гипобиоза на количество липидов в тимоцитах крыс

О.В. Быкова, Л.Н. Маркевич, И.К. Коломийцева
Институт биофизики клетки РАН, Пущино

Исследовано влияние искусственного гипобиоза в условиях гипоксии – гиперкапнии крыс на количество фосфолипидов и нейтральных липидов в тимоцитах. Впервые показано участие кардиолипина в адаптивных реакциях тимоцитов на состояние искусственного гипобиоза. Показана адаптивная роль жирных кислот, диглицеридов и фосфолипидов в метаболическом ответе тимоцитов на искусственный гипобиоз крыс.

Введение

Актуальной проблемой космической биологии и практической медицины является исследование адаптации человека и животных к низким температурам окружающей среды. У незимоспящих млекопитающих состояние гипометаболизма можно создать в условиях гипотермии с использованием гипокси–гиперкапнических газовых сред. При этом животные впадают в состояние так называемого «холодового наркоза» или искусственного гипобиоза со снижением уровня метаболизма в 6–7 раз при температуре тела 14–23°С. Из этого состояния животные возвращаются к норме без патологических последствий [1, 2]. Искусственная гипотермия широко применяется в медицинской практике, это связано со значительным снижением обмена веществ и потребления кислорода при пониженной температуре с последующим восстановлением физиологических функций после нормализации температуры. Различают общую и локальную гипотермию. Общая гипотермия подразделяется на мягкую (35–32°С), при которой обычно используется легкая нейровегетативная фармакологическая блокада, и умеренную (32–27°С) с современным многокомпонентным интубационным наркозом, с искусственной аппаратной вентиляцией легких, релаксацией и нейровегетативной блокадой [3–6]. Для адаптационной медицины, космической биологии и физиологии стресса представляет большой интерес изучение влияния глубокой гипотермии (ниже 27°С). В этом плане перспективны изучение состояния искусственного гипобиоза у незимоспящих млекопитающих [7, 8].

В адаптации живых систем к экстремальным температурам окружающей среды большая роль приписывается липидам [9–11]. Особый интерес представляет исследование липидов ядер в связи с ролью липидов в сигнальных системах клетки [12–14]. Несмотря на интерес к проблеме роли липидов в гипотермии, влияние низких температур и искусственного гипобиоза на липиды тканей млекопитающих не исследовано.

Экспериментальная часть

Цель нашей работы – выяснение участия липидов ядер клеток тимуса в адаптации млекопитающих к искусственному гипобиозу. Тимус является активно пролиферирующим и одним из основных органов иммунной системы. Тимус очень чувствителен к действию различных факторов, вызывающих апоптоз клеток, и состоит на 95–98% из лимфоцитов [15]. Известно, что время жизни делящихся клеток тимуса составляет примерно 1 сутки [16]. Основную часть объема тимоцита занимает ядро. Липидный состав тимоцитов близок к липидному составу ядер тимоцитов [17]. Опыты проводили на крысах-самцах Wistar массой 190–220 г. Для введения в состояние искусственного гипобиоза использовали метод гипоксии-гиперкапнии [2]. Крыс выдерживали в герметичной камере объемом 5 л при температуре среды 1–2°С в течение 3.5–4 ч. Все процедуры с животными проводили в соответствии с требованиями институтской комиссии по этике и Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (European Communities Council Directive (86/609/EEC).

Таблица
Количество индивидуальных липидов в тимоцитах крыс в состоянии искусственного гипобиоза и через 24 часа после окончания процедуры охлаждения (мкг липида/1 мг белка)

* – Различие достоверно по отношению к контролю при р < 0.05;
** – различие достоверно по отношению к контролю при р < 0.001; в скобках указано количество экспериментов.

Крыс декапитировали согласно принятым в ИБК РАН правилам [18] в состояниях нормотермии (t тела 37°С), искусственного гипобиоза (t тела 15–18°С) и через 24 часа после окончания процедуры охлаждения (t тела 37°С). При получении суспензии тимоцитов суммировали материал от 3-х животных. Липиды экстрагировали, очищали, разделяли методом ТСХ и определяли количество индивидуальных нейтральных липидов и фосфолипидов [19, 20]. Количество белка определяли по Лоури. Для статистической обработки использовали t-тест Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

В состоянии искусственного гипобиоза крыс в тимоцитах увеличивалось содержание фосфатидилхолина (ФХ) на 28%, фосфатидилинозитола (ФИ) в 2 раза, фосфатидилэтаноламина (ФЭА) на 23% и свободных жирных кислот почти в 2 раза, количество кардиолипина уменьшалось на 59% (таблица); через 24 часа после окончания процедуры охлаждения содержание фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и свободных жирных кислот приходило в норму, оставалось повышенным количество фосфатидилинозитола в 2.3 раза, увеличивалось содержание фосфатидилсерина (ФС) в 2.4 раза и диглицеридов в 1.7 раз, количество кардиолипина уменьшалось в 2.3 раза. Количество остальных липидов, а именно холестерина, моноглицеридов, сфингомиелина (СМ), не изменялось.

ФХ, как и другие липиды, является участником сигнальных систем, его метаболизм тесно связан с метаболизмом СМ, ФЭА, ФС и ФИ [21]. На Т-лимфоцитах крови показано, что синтез de novo и накопление ФХ и рост отношения фосфатидилхолин/сфингомиелин происходят на стадии активации пролиферации в культуре тимоцитов, стимулированных IL-II [22]. Искусственный гипобиоз вызывает в тимоцитах рост отношения ФХ/СМ за счет увеличения количества ФХ. Можно полагать, что повышение уровня ФХ, ФЭА ;и стойкое увеличение ФИ (таблица) имеют адаптивный характер и направлены на поддержание клеточной пролиферации.

Концентрация кардиолипина в ядрах тимоцитах равна его концентрации в клетке [17]. Можно предположить, что кардиолипин ядер вносит существенный вклад в кардиолипин тимоцитов, а искусственный гипобиоз оказывает влияние на кардиолипин ядер тимоцитов. Известно, что среди ДНК-связанных липидов кардиолипин занимает особое место, весь кардиолипин хроматина локализован в ДНК и ядерном матриксе и регулирует, например, активность ДНК- и РНК-полимераз, протеинкиназы С [23]. Стойкое снижение содержания кардиолипина, сохраняющееся через 24 часа после окончания охлаждения, на фоне снижения активности ОДК и пролиферативной активности в тимоцитах [24] может свидетельствовать о роли кардиолипина в клеточной пролиферации и нарушениях функционирования внутренней мембраны митохондрий тимоцитов [25, 26].

У крыс в состоянии искусственного гипобиоза происходил рост количества свободных жирных кислот в тимоцитах. Известно, что в состоянии искусственного гипобиоза увеличивается количество насыщенных жирных кислот в крови и сердечной мышце крыс [7], такое же изменение в количестве жирных кислот отмечено в крови при разной степени гипотермии и других видах стресса и рассматривается какследствие общей реакции организма млекопитающих [9].

Через 24 часа после окончания процедуры охлаждения количество основных фосфолипидов не отличалось от контрольных значений. Было отмечено увеличение количества минорных фосфолипидов, таких как фосфатидилинозитол и фосфатидилсерин более чем в 2 раза (таблица). Таким образом, по сравнению с состоянием гипобиоза происходит уменьшение количества ФХ и ФЭА, соответственно растет количество диглицеридов, что свидетельствует об активации сигнальных путей и функциональной роли липидов. Из анализа результатов следует, что липиды играют важную функциональную роль в адаптивном ответе, участвуя в регуляции пролиферации и метаболизме тимоцитов в состоянии искусственного гипобиоза крыс.

Заключение

Состояние искусственного гипобиоза при температуре тела 15–18°С в условиях гипоксии-гиперкапнии вызывает адаптивные изменения метаболизма липидов, обеспечивающие выживание млекопитающих в экстремальных условиях. Изучение механизмов искусственных гипометаболических состояний представляет интерес для адаптационной медицины.

В настоящем исследовании показана функциональная роль липидов в механизмах адаптации незимоспящих млекопитающих к искусственному гипобиозу. Исследовано участие липидов в динамике функционального состояния тимоцитов в ответ на искусственный гипобиоз. Выявлено участие фосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола, фосфатидилэтаноламина, кардиолипина, свободных жирных кислот и диглицеридов в динамике адаптации тимоцитов к искусственному гипобиозу.

Авторы выражают глубокую благодарность Дмитрию Александровичу Игнатьеву за обучение методу «закрытого сосуда» и помощь в работе.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 09-04-00993-а).

Список литературы

1. Майстрах Е.В. Гипотермия и анабиоз. М.–Л.: Наука, 1964. 327 с.
2. Игнатьев Д.А., Фиалковская Л.А., Перепелкина Н.И., Маркевич Л.Н. и др. // Радиац. биол. Радио-экол. 2006. Т. 46. № 6. С. 705–712.
3. Edwards S.L. Uses of therapeutic hypothermia // Prof. Nurse. 1999. V. 14. № 6. P. 405–409.
4. Liu L., Yenari M.A. Clinical application of therapeutic hypothermia in stroke // Neurol. Res. 2009. V. 31. № 4. P. 331–335.
5. Marion D., Bullock M.R. Current and future role of therapeutic hypothermia // J. Neurotrauma. 2009. V. 26. № 3. P. 455–467.
6. Turk E.E. Hypothermia // Forensic. Sci. Med. Pathol. 2010. V. 6. № 2. P. 106–115.
7. Тимофеев Н.Н. Гипобиоз и криобиоз. Прошлое, настоящее, будущее. М.: Информ–Знание, 2005. 256 с.
8. Игнатьев Д.А., Воробьев В.В., Сухова Г.С., Зиганшин Р.Х. и др. Зимняя спячка и искусственный гипобиоз (изучение нейрохимических факторов гибернации) // Нейрохимия. 1998. Т. 15. № 3. С. 240–263.
9. Гурин В.Н. Обмен липидов при гипотермии, гипертермии и лихорадке. Минск: Беларусь, 1986. 190 с.
10. Aloia R.C., Raison I.K. Membrane function in mammalian hibernation // Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 988. P. 123–146.
11. Dark J. Annual lipid cycles in hibernators: integration of physiology and behavior // Annu. Rev. Nutr. 2005. V. 25. P. 469–497.
12. Brown D.A., London E. Functions of lipid rafts in biological membranes // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1998. V. 14. P. 111–136.
13. Alessenko A.V., Burlakova E.B. Functional role of phospholipids in the nuclear events // Bioelectrochemistry. 2002. V. 58. № 1. P. 13–21.
14. Albi E., Lazzarini R., Magni M.V. Phosphatidylcholine/sphingomyelin metabolism crosstalk inside the nucleus // Biochem. J. 2008. V. 410. № 2. P. 381–389.
15. Ярилин А.А. Иммунология. Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 752 c.
16. Egerton M., Scollay R., Shortman K. Kinetics of mature T-cell development in the thymus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. № 7. P. 2579–2582.
17. Kolomiytseva I.K., Kulagina T.P., Markevich L.N., Arkhipov V.I. et al. Nuclear and chromatin lipids: metabolism in normal and gamma-irradiated rats // Bioelectrochemistry. 2002. V. 58. № 1. P. 31–39.
18. Регламентация работы с лабораторными животными / Под ред. А.А. Кудрявцевой. Пущино: АН СССР, 1983. 8 с.
19. Кулагина Т.П., Шурута С.С., Коломийцева И.К. Метаболизм нейтральных липидов ядер и хроматина тимоцитов крыс в норме и после γ-облучения // Биохимия. 1993. Т. 58. № 2. С. 295–299.
20. Коломийцева И.К., Маркевич Л.Н., Игнатьев Д.А., Быкова О.В. Липиды ядерных фракций нейронов и глии неокортекса при искусственном гипобиозе крыс // Биохимия. 2010. Т. 75. № 9. С. 1265–1272.
21. Nohturfft A., Zhang S.C. Coordination of lipid metabolism in membrane biogenesis // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2009. V. 25. P. 539–566.
22. Flores I., Jones D.R., Mérida I. Changes in the balance between mitogenic and antimitogenic lipid second messengers during proliferation, cell arrest, and apoptosis in T-lymphocytes // FASEB J. 2000. V. 14. № 13. P. 1873–1875.
23. Стручков В.А., Стражевская Н.Б. ДНК-связанные липиды: состав и возможные функции // Биохимия. 1993. Т. 58. № 8. С. 1154–1175.
24. Аксёнова Г.Е., Логвинович О.С., Фиалковская Л.А., Афанасьев В.Н. и др. // Биохимия. 2010. Т. 75. Вып. 9. С. 1257–1264.
25. Милейковская Е., Жанг М., Доухан В. Роль кардиолипина в энергозапасающих мембранах // Биохимия. 2005. Т. 70. № 2. С. 191–196.
26. Chicco A.J., Sparagna G.C. Role of cardiolipin alterations in mitochondrial dysfunction and disease // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2007. V. 292. №. 1. P. C33–C44.