Вы здесь

Проблемы криосохранения мозга и мозговой ткани животных

Автор: Пичугин Ю.И.

Уже показано, что холодовой анабиоз целого организма некоторых животных возможен. Так сибирский углозуб (Hynobius keyserlingi) может находиться в холодовом анабиозе сотню, а может быть и тысячу лет с полным, спонтанным восстановлением функций организма, включая нормальную работу мозга [1]. Это яркий пример природного криосохранения. Но не все организмы, даже среди земноводных, способны к такому естественному анабиозу. Зимой в организме углозуба накапливается глицерин до 17% от веса тела. Он синтезируется из гликогена печени. Глицерин предохраняет клетки организма углозуба от замерзания [2].

Биология человеческого мозга значительно отличается от биологии мозга углозуба. Человеческий мозг, как и мозги других теплокровных негибернирующих животных, не способен полностью восстанавливать свою функцию даже после его гипотермии ниже +29°С. При этом наблюдаются неврологические расстройства. Гибернирующие же животные способны полностью восстанавливать свою мозговую активность при охлаждении до 0°С.

Тем не менее, японские учёные ещё в 1966 году продемонстрировали замораживание изолированного мозга кошки с сохранением биоэлектрической активности [3]. Для защиты клеток от замораживания использовался природный криопротектор глицерин в конечной концентрации 15%. Замороженный мозг кошки хранился при -20°С от 45 до 203 дней. ЭЭГ деконсервированного мозга была близкой нормальной ЭЭГ. Видоизменённая биоэлектрическая активность деконсервированного кошачьего мозга наблюдалась при хранении замороженного мозга в течение 777 дней и даже 7,25 лет [4]. Ни одному учёному не удалось успешно повторить эти опыты. Возможно секрет успеха японских учёных заключается в том, что необходимо правильно, очень медленно охлаждать глицеринизированный мозг до -20°С так, чтобы лёд образовывался только вне, но не внутри клеток. Криобиологи давно уже доказали, что образование внутриклеточного льда убивает клетки. Если замороженных углозубов охладить не до -30°С, а до -50°С, когда произойдёт внутриклеточная кристаллизация льда, то они погибают.

С 1985 года прогресс в криосохранении тканей и целых органов возрос благодаря открытию витрификационного метода криоконсервирования [5]. Этот метод позволяет полностью избежать образования льда при охлаждении клеток и тканей до -196°С. Наиболее значительным достижением в этой области криобиологии является криосохранение почки кролика, которая жила 9 дней после её трансплантации [6]. Основная проблема витрификационного метода для криосохранения органов заключается в том, что для полного устранения кристаллизации льда требуются высокие концентрации смесей криопротекторов от 55% и выше. Такие концентрации оказывают токсическое действие на клетки органов. Это проблема до сих пор не решена.

Тем не менее, витрификационный метод успешно применяется для криосохранения небольших по размерам кусочков ткани, например артерий. Для таких объектов можно создать высокие скорости охлаждения и отогревания (выше 20°С в минуту) и, тем самым, снизить концентрацию криопротекторов (ниже 55%) до нетоксических уровней. Таким способом удалось успешно сохранить даже такую легкоранимую ткань как нервная ткань [7]. Однако в этих экспериментах применялся только калиево-натриевый тест для оценки жизнеспособности срезов гиппокампа крыс. Хотя дополнительно были представлены фотографии электронно-микроскопических препаратов с хорошей сохранностью тонкой структуры клеток нервной ткани.

В начале 2012 года нами совместно с лабораторий экспериментальной нейробиологии Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН проведены опыты по криосохранению срезов гиппокампа крыс с применением регистрации биоэлектрической активности. Гиппокамп является одной из наиболее важных структур мозга, участвующих в процессах обучения и памяти. Повреждение гиппокампа нарушает кратковременную память и делает невозможным консолидацию новой информации.

Для витрификации срезов гиппокампа была использована 48% витрификационная смесь, состоящая из 36% этиленгликоля и 12% диметилсульфоксида. Эта смесь криопротекторов была выбрана на основании предыдущих опытов [7]. Согласно калиево-натриевому тесту применение этой смеси давало 100% выживаемость срезов гиппокампа крыс после их криосохранения. Увеличение концентрации криопротекторов в этой среде приводило к увеличению токсичности, а уменьшение концентрации – к невозможности осуществить успешную витрификацию срезов по стандартной методике охлаждения – нагревания. Регистрация биоэлектрической активности срезов после инкубации с 48% смесью криопротекторов показала, что срезы могут стабильно жить в течение обычного времени переживания срезов гиппокампа крыс. Однако амплитуда популяционных спайков этих срезов составляла в среднем 50% от амплитуды контрольных срезов. Возможно, что и остальные нейроны в срезе живы, если калиево-натриевый тест показывает 100% выживаемость, но некоторые нейроны не могут полноценно проводить электрические импульсы из-за нарушений в синапсах. Это может снижать амплитуды популяционных спайков. Общепринятым считается, что самым чувствительным местом нервных клеток являются их синапсы, и при каких-либо негативных воздействий на нервную ткань страдают, прежде всего, они. Популяционные спайки, в отличие от калиево-натриевого теста, отражают функциональные состояния синапсов, и поэтому являются более чувствительным тестом на нормальное функционирование нервной ткани.

Мы считаем, что можно намного улучшить результаты криосохранения срезов гиппокампа, снижая токсичность витрификационной смеси, путем понижения концентрации криопротекторов в ней, но тогда нужно будет применять новую методику более быстрого охлаждения – нагревания. Такая методика найдена, и появилась возможность добиться большей выживаемости мозговых срезов после их витрификации по тесту регистрации популяционных спайков и, возможно, даже получить длительную потенциацию.

При переходе от витрификации тонких срезов мозговой ткани к витрификации целого мозга возникают дополнительные проблемы. Главная проблема в том, что невозможно было получить высокие скорости охлаждения – отогревания для голов крыс, поэтому приходилось увеличивать концентрации криопротекторов (выше 55%) для того, чтобы получить стабильную витрификацию. Не менее важной проблемой оказалось то, что даже наилучшие витрификационные смеси плохо проникали через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), вызывая при этом сильное обезвоживание мозга (до 70%), которое приводило к резкому снижению выживаемости мозговой ткани после криоконсервирования. Этой проблемы не было для тонких мозговых срезов, так как криопротекторы свободно проникали в них простой диффузией, а не через кровеносные сосуды, как это бывает при перфузии целого мозга.

Проблема сильного сжатия мозга при криопротекторной перфузии была решена с помощью применения определенных соединений, названных модификаторами гематоэнцефалического барьера, или ГЭБ модификаторами. Эта была пионерская работа, и впервые в мире нам удалось добиться 70% выживаемости мозговой ткани после витрификации целого мозга крыс. Наилучшее методы криоконсервирования целого мозга крыс без применения ГЭБ модификаторов могли дать только 10-20% выживаемость мозговой ткани. Сами ГЭБ модификаторы не обладают выраженным токсическим действием.

Можно привести ещё пример высокой эффективности ГЭБ модификаторов. 35% этиленгликоль при определенных условиях нетоксичен для мозговых срезов крыс. Они могут выживать на 100% после экспозиции с этиленгликолем при 0°С. Однако выживаемость мозговой ткани падает до 40%, если перфузировать целый мозг крыс при той же температуре - в результате сильного обезвоживания мозга. Но, если при перфузии применялись ГЭБ модификаторы и мозг не обезвоживался, то выживаемость мозговой ткани была 100%, как в случае с мозговыми срезами. Открытый нами способ криосохранения целого мозга крыс с применением ГЭБ модификаторов позволит в перспективе получить до 90% выживаемости мозга крыс согласно калиево-натриевому тесту.

Литература

1. Щербак Н.Н., Ковалюх Н.Н. О возрасте живого земноводного из ископаемого льда // Докл. АН СССР. — 1973. — Т. 211, N 4. — С. 1003-1004.
2. Берман Д.И., Лейрих А.Н., Михайлова Е.И. О зимовке сибирского углозуба Hynobius keyserlingi на Верхней Колыме // Ж. эвол. биох. и физиол. — 1984. — Т. 20, N 3. — С. 323-327.
3. Suda I., Kito K., Adachi C. Viability of long term frozen cat brain in vitro // Nature. — 1966 — Vol. 212, N 59 — P. 268–270. 
4. Suda I., Kito K., Adachi C. Bioelectric discharges of isolated cat brain after revival from years of frozen // Brain Res. — 1974 — Vol. 70, N 3 — P. 527–531.
5. Rall W.F., Fahy G.M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at −196°C by vitrification // Nature. — 1985 — Vol. 313, N 6003 — P. 573–575.
6. Fahy G.M., Wowk B., Pagotan R., et al. Physical and biological aspects of renal vitrification // Organogenesis. — 2009 — Vol. 5, N 3 — P. 167–175.
7. Pichugin Y., Fahy G.M., Morin R. Cryopreservation of rat hippocampal slices by vitrification // Cryobiology. — 2006. — Vol. 52, N 2 — P 228-240.

Поделиться